Procalcitonin und proinflammatorische Zytokine in der bronchoalveolären Lavage beim lungenkranken Pferd unter inhalativer Glukokortikoidtherapie

Abstract

Procalcitonin (PCT) ist das Vorläuferhormon des Hormons Calcitonin und wird in der Humanmedizin als Entzündungsmarker erfolgreich eingesetzt. Neben dem Hauptanwendungsgebiet der Sepsisdiagnostik dient PCT in der Humanmedizin auch der Diagnose bzw. Verlaufskontrolle verschiedener Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD. Proinflammatorische Interleukine sind an der Entstehung verschieder Atemwegserkrankungen von Mensch und Pferd beteiligt und scheinen außerdem zu einer vermehrten Bildung von Procalcitonin im Rahmen infektiöser Geschehen beizutragen. Ziel der vorliegenden Studie war es, Procalcitonin erstmals mittels spezieller ELISA-Tests (RIEGER et al., 2014) in Blutplasma (n = 18) und bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit (BALF) (n = 68) von Pferden mit verschiedenen Lungenerkrankungen zu bestimmen. Diese Ergebnisse sollten zum einen in Bezug auf übliche klinische Parameter der Lungendiagnostik betrachtet und zum anderen mit den Konzentrationen einiger proinflammatorischer Interleukine (IL-1β, IL-6, IL-17) in der BALF (n = 68) verglichen werden. Letztere wurden anhand kommerzieller ELISA-Kits der Marke USCN bestimmt. Einige chronisch lungenkranke Patienten (n = 12) wurden zusätzlich einer zehntägigen inhalativen Therapie mit dem Glukokortikoid Budesonid (1.500 μg BID) unter staubarmen Haltungsbedingungen unterzogen. Im Anschluss an die Behandlung wurde der klinische Status der Patienten sowie die Ausprägung der verschiedenen Biomarker in der BALF erneut evaluiert. Insgesamt wurden 68 Probanden in die vorliegende Studie aufgenommen. Davon wurden 53 Patienten zur Abklärung tiefer Atemwegserkrankungen an der Klinik für Pferde der Freien Universität Berlin vorgestellt. Die restlichen 15 Pferde waren vorberichtlich und klinisch lungengesund und dienten somit als Kontrollgruppe. Nach standardisierter Untersuchung (Vorberichterhebung, klinische Untersuchung der Atemwege, arterielle Blutgasanalyse, Lungenfunktionsuntersuchung, Thorax- Röntgen, Tracheobrochoskopie, zytologische Untersuchung der BALF) wurden die Probanden folgenden Diagnosegruppen zugeordnet: Lungengesund (n = 15), recurrent airway obstruction (RAO) oder chronisch obstruktive Bronchitis (COB) in Exazerbation (n = 21), chronisch obstruktive Bronchitis (COB) in Remission oder inflammatory airway disease (IAD) (n = 16), chronisch interstitielle Pneumopathie (CIP) (n = 12) und (sub)-akute Pneumonie (n = 4). Anhand eines modifizierten Score-Systems nach OHNESORGE et al. (1998) konnten die Patienten außerdem hinsichtlich des Schweregrads der vorliegenden Erkrankung beurteilt werden. Lungenkranke Pferde zeigten sowohl in der BALF (p = 0,006) als auch in Blutplasma (p = 0,05) signifikant höhere PCT-Konzetrationen als die gesunden Kontrolltiere. Obwohl Pferde mit RAO bzw. COB in Exazerbation und solche mit COB in Remission oder IAD die höchsten durchschnittlichen PCT-Mengen in BALF (Kontrollgruppe: 5,5 ng/ml; RAO/COB in Exazerbation: 13,4 ng/ml; COB in Remission/IAD: 16,9 ng/ml) und Blutplasma (Kontrollgruppe: 13,9 ng/ml; RAO/COB in Exazerbation: 482,2 ng/ml; COB in Remission/IAD: 98,6 ng/ml) aufwiesen, war eine genaue Differenzierung einzelner Gruppen mittels dieses Markers nicht möglich. Nichtdestotrotz wurde eine gute Korrelation zwischen PCT-Mengen in BALF und Blutplasma gezeigt. Außerdem wurden insbesondere für PCT in Blutplasma positive Zusammenhänge mit klinischen Parametern (kinischer Score, Kalziumkonzentration im Blut, Atemfrequenz, PaO2 und bronchiale Röntgenbefunde) vorgefunden. Für die Interleukine wurden einige Tendenzen beobachtet, allerdings lagen diese nicht im statistisch signifikanten Bereich. Gute Korrelationen zeigten sich zwischen IL-1β und -6 sowie zwischen den Zytokinen und einigen klinischen Befunden. Das Interleukin-6, das bei Pferden mit RAO bzw. COB in Exazerbation den höchsten Medianwert aufwies (Kontrollgruppe: 2,5 pg/ml; RAO/COB in Exazerbation: 11 pg/ml), zeigte als einziger Marker schwache Korrelationen zur BALF-Neutrophilie und als einziges Interleukin einen Zusammenhang zum klinischen Score. Durch die bei der Durchführung des ELISA-Tests aufgetretenen Probleme erfolgte für IL-17 ausschließlich eine qualitative Beurteilung der Zytokinmengen. Des Weiteren konnten in der vorliegenden Studie keine Wechselwirkungen zwischen den proinflammatorischen Interleukinen und Procalcitonin nachgewiesen werden. Nach inhalativer Behandlung wurde allgemein eine deutliche Verbesserung des klinischen Status beobachtet, welche in einer erheblichen Senkung des klinischen Scores Ausdruck fand (p = 0,005). Nach Inhalation wurden insgesamt leicht höhere PCT-Werte (Median: 16,5 ng/ml) als zuvor (Median: 13,8 ng/ml) gemessen, allerdings war dieser Unterschied aus statistischer Sicht nicht relevant. Bei Betrachtung der einzelnen Patienten zeigten außerdem die eine Hälfte erniedrigte Procalcitoninkonzentrationen, während bei der anderen Hälfte diese deutlich erhöht waren. Für die Interleukine 1β (p = 0,016) und 17 (p = 0,002) wurde nach Therapie ein signifikanter Anstieg der gemessenen Werte in der BALF festgestellt. Anders zeigten Pferde mit akutem RAO bzw. COB-Schub eine deutliche Senkung der IL-6-Konzentrationen in der BALF nach Therapie (p = 0,036). Die vorliegende Studie ermöglichte erstmals eine direkte Quantifizierung der Konzentrationen von Procalcitonin in Blut und BALF lungenkranker Pferde. Des Weiteren wurden wichtige Informationen bezüglich der tatsächlichen Mengen bestimmter proinflammatorischer Interleukine in der BALF gewonnen, dessen Bestimmung bis heute fast ausschließlich auf transkriptioneller Ebene durchgeführt wurde. Bei Betrachtung dieser Ergebnisse scheint PCT in der BALF bereits etablierten Markern nicht überlegen zu sein. PCT in Blutplasma, welches die lokale Lungenentzündung gut wiederspiegelt, scheint dagegen ein versprechendes Mittel zur Diagnose tiefer Atemwegserkrankungen des Pferdes darzustellen und sollte durch weitere Untersuchungen an größeren Stichproben weiterführend evaluiert werden. Für die Interleukine konnten weder relevante Gruppenunterschiede noch eine Korrelation zu PCT aufgedeckt werden. PCT scheint auch beim Pferd, wie beim Menschen bereits bekannt, durch Steroide kaum beeinflusst zu werden. Während für IL-1β und 17 nach Glukokortikoidinhalation eine deutliche Steigerung in der BALF festgestellt wurde, zeigte IL-6 als einziges Interleukin eine partielle dennoch deutliche Senkung nach Therapie. Um die vorliegenden Ergebnisse zu bestätigen, sind allerdings weitere Untersuchungen an größeren Fallzahlen und unter Einschluss einer Placebo-Kontrollgruppe nötig.

Procalcitonin (PCT), the precursor protein of the hormone calcitonin, is a sensitive inflammatory marker in human medicine. Besides the investigation of human sepsis, which remains the main field of application for PCT diagnostic, this protein is also used to diagnose and monitor different respiratory diseases like asthma and COPD. Proinflammatory cytokines are known to play an essential role in airway inflammation of both horses and men. Furthermore they also seem to trigger hyperprocalcitonemia in case of infection. The first aim of the present study was to determine procalcitonin concentrations in blood plasma (n = 18) and bronchoalveolare lavage fluid (BALF) (n = 68) of horses with different pneumopathies. Therefore a specific ELISA test (RIEGER et al., 2014) was used. Furthermore PCT concentrations were compared with conventional clinical findings and with the amount of proinflammatory interleukins (IL-1β, IL-6, IL-17) in the BALF (n = 68). The concentrations of these cytokines were also measured by ELISA, using commercially available kits of the brand USCN. Subsequently some horses with chronic pulmonary disease (n = 12) were submitted to inhalation therapy with the glucocorticoid budesonide (1,500 μg BID) under low dust environment. After ten days of inhalation the clinical status of the patients as well as the concentration of the biomarkers in BALF was evaluated again. A total of 68 patients were included into this study: 53 horses were presented at the equine clinic of Freie Universität Berlin due to respiratory problems. The remaining 15 horses, which had no history of lung disease and resulted as sound according to clinical investigations, were used as the healthy control group. After an extensive pre-participation examination (anamnesis documentation, clinical examination, exercise test, blood gas analysis, bronchoscopy, BALF cytology and thoracic radiography) the patients were assigned to one of the following groups: healthy (n = 15), recurrent airway obstruction (RAO) in exacerbation (n = 21), recurrent airway obstruction (RAO) in remission or inflammatory airway disease (IAD) (n = 16), chronic interstitial pneumopathy (CIP) (n = 12) and (sub)acute pneumonia (n = 4). Finally using a modified score system (OHNESORGE et al., 1998) horses were evaluated according to the severity of the diagnosed disease. Overall, horses affected by respiratory disease showed increased PCT concentrations in both BALF (P = 0.006) and blood plasma (P = 0.05) compared to controls. Patients with RAO in exacerbation and those with RAO in remission or IAD showed the highest median values for PCT in BALF (controls: 5.5 ng/ml; RAO in exacerbation: 13.4 ng/ml; RAO in remission/IAD: 16.9 ng/ml) and blood plasma (controls: 13.9 ng/ml; RAO in exacerbation: 482.2 ng/ml; RAO in remission/IAD: 98.6 ng/ml), but this marker did not allow a differentiation between the single disease groups. However, a moderate correlation between PCT in BALF and blood plasma was detected and the concentration of PCT in plasma had stronger coefficients of correlation to clinical findings (clinical score, calcium concentration in blood, respiratory rate, PaO2 and bronchial radiological findings). For interleukins no significant differences could be found. Correlations were found between IL-1β und IL-6 as well as between the cytokines and some clinical parameters. Interleukin-6 showed the highest median value within the group of horses with RAO in exacerbation (controls: 2.5 pg/ml; RAO in exacerbation: 11 pg/ml). Moreover it was the only biomarker which had a weak association to BALF neutrophilia and the only interleukin correlating with the clinical score. Due to some problems encountered during the performance of the IL-17 ELISA, only qualitative assessment was possible in this case. No correlations were found between PCT and any of the proinflammatory cytokines examined in this study. After inhalative therapy horses showed a clear improvement in clinical status which was pointed up by the general decrease in score points achieved by all patients (P = 0.005). After inhalation a slight increase, albeit not significant, was found for median PCT concentrations (before therapy: 13.8 ng/ml; after therapy: 16.5 ng/ml). However, a closer look to the single patients showed that about one half of them had reduced PCT concentrations, while the other half displayed clear increases. The interleukins 1β (P = 0.016) and 17 (P = 0.002) presented significantly elevated concentrations in the alveolar space after therapy, whereas a clear decrease of IL-6 values (P = 0.036) was detected in the BALF of horses with RAO in exacerbation. This study represents the first attempt to quantify the concentrations of procalcitonin both in blood and in the alveolar space of horses afflicted by respiratory diseases. Moreover, new insights concerning the effective concentrations of some proinflammatory interleukins in the BALF of the same horses were given, since up to date these markers have mainly been characterised on transcriptional level. Regarding the present results PCT in BALF seems not to be a superior marker compared to established clinical markers in low-grade inflammation. Nevertheless PCT in blood plasma represented local lung inflammation well and showed a better correlation to the clinical condition of the examined horses. So PCT in blood seems to be a more promising marker to characterize airway diseases and it should be evaluated in further studies including larger patient groups. Interleukins in BALF showed neither significant differences between disease groups nor a correlation to the measured procalcitonin values. Equine PCT seems not to be influenced by steroids, as for human PCT already proven. Interleukin 1β and 17 were higher after therapy, whereas interleukin-6 was the only marker which showed a partial but significant decrease subsequently to glucocorticoid inhalation. To confirm this results further studies are needed, where larger numbers of patients are examined and a placebo group is included.