Genexpressionsanalysen zum besseren Verständnis von Knochenheilung und -entwicklung

Abstract

Für ein besseres Verständnis der Knochenentwicklung und -heilung ist es notwendig, mehr Informationen über die daran beteiligten Gene zu erhalten. Dazu sind Ansätze aus der klinischen Forschung sowie der Grundlagenforschung geeignet, und auch evolutionsbiologische Ansätze können wertvolle Hinweise zur Biologie des Skeletts liefern. Als klinischer Forschungsansatz zum besseren Verständnis der Frakturheilung wurden in der vorliegenden Arbeit cDNA-Banken aus verschiedenen Stadien von Frakturkallusgewebe des Schafs erstellt und daraus Sequenzen von über 47000 ESTs generiert. Aus der Analyse der EST-Zahlen für einzelne Gene in den cDNA-Banken und zusätzlichen quantitativen PCRs konnten 87 Kandidatengene mit einer möglichen Funktion im Heilungsprozeß identifiziert werden. Darunter befanden sich auch 53 Gene, denen bisher keine Funktion in der Entwicklung oder Heilung des Knochens zugeschrieben wurde. Neben der Identifikation dieser Gene stellen die EST-Sequenzen auch eine wichtige Ressource für andere Arbeiten mit dem Schaf als Modellorganismus dar. In einem grundlagenorientierten, entwicklungsbiologischen Ansatz wurden Gene mit potentieller Funktion in der Skeletogenese durch Vergleiche von Expressionsprofilen im Runx2-Mausmodell identifiziert. Runx2 kodiert einen für die Skeletogenese essentiellen Transkriptionsfaktor. Die Hybridisierung von Affymetrix GeneChip Arrays mit RNA aus Oberarmknochen von E14,5 Runx2-Wildtyp- und Knockout-Embryonen lieferte 71 differentiell exprimierte Transkripte, die durch quantitative PCR bestätigt werden konnten. Von diesen war bisher für 31 Gene noch keine Funktion in der Skeletogenese beschrieben. Nach der Bestimmung des Expressionsmusters der Kandidatengene durch in situ-Hybridisierung wurde eine evolutionsbiologischer Ansatz benutzt, um potentiell direkt durch Runx2 regulierte Gene aufzudecken. Hierbei wurden die Promotorbereiche der Kandidatengene nach Runx-Bindungsstellen durchsucht, die zwischen mehreren Spezies konserviert sind. Durch diese Methode konnten fünf neue potentielle Runx2-Zielgene identifiziert werden. Weiterhin konnten durch Untersuchungen zur Evolution der Runt-Genfamilie Erkenntnisse über die Evolution der molekularen Mechanismen der Skeletogenese gewonnen werden. Die Klonierung und phylogenetische Analyse von drei Runt-homologen Gene des Kleingefleckten Katzenhais Scyliorhinus canicula zeigte, daß diese zu den drei bei Säugetieren vorhanden Runx1-3 Genen ortholog sind. Expressionsanalysen der Runt-homologen Genen des Katzenhais, Schleimaals und Lanzettfischchens, sowie des für die Skeletogenese der Vertebraten ebenfalls wichtigen Sox9-Gens im Lanzettfischchen deuten darauf hin, daß diese Gene eine evolutionär konservierte Funktion in der Entwicklung des Skeletts bzw. seiner Vorläuferstrukturen besitzen. Es konnte gezeigt werden, daß diese für die Skeletogenese wichtige molekulare Maschinerie zudem bereits bei den Cephalochordata und nicht wie bisher vermutet erst bei den Vertebrata vorhanden ist und damit etwa 100 Millionen Jahre älter ist, als bisher angenommen wurde.

In order to gain a deeper understanding of bone development and regeneration it will be necessary to learn more about the genes involved in these processes by clinical and basic-science research. Evolutionary biology can also provide us with valuable hints about skeletal biology. In the present work cDNA libraries from different stages of sheep fracture callus tissue were constructed from which over 47,000 expressed sequence tags (ESTs) were sequenced. The EST distribution for genes in the different cDNA libraries was analyzed, and quantitative RT-PCR analysis was additionally performed for 87 genes with a potential function during fracture healing. Among these were 53 genes, for which a function in skeletal devlopment or in fracture repair had not been previously reported. Besides the identification of novel candidate genes for fracture healing, the EST sequences are an important resource for research using the sheep as model organism. In a developmental approach, expression profiles of E14.5 Runx2 wildtype and knockout mouse humeri were compared in order to find genes with relevance for skeletogenesis. Runx2 encodes a transcription factor that is essential for skeletogenesis. In this screen, 71 transcripts were found to be differentially expressed and were confirmed by real-time PCR. For 31 of these genes, a role in skeletogenesis has not yet been described. After determination of the expression patterns of the candidate genes, an evolutionary biology approach was used to identify potential direct Runx2 target genes. Promoter regions of candidate genes were screened for Runx2 binding sites that are conserved between different species. Using this approach five novel potential Runx2 target genes were identified. Furthermore the analysis of Runt gene family evolution led to novel insights into the molecular mechanisms of skeletogenesis. Cloning and phylogenetic analysis of three Runt homologous genes of the lesser spotted dogfish Scyliorhinus canicula showed that the dogfish Runt genes are orthologs of the mammalian Runx1-3 genes. Expression analysis of the Runt homologous genes of dogfish, hagfish and amphioxus as well as the amphioxus Sox9 indicates, that these genes have an evolutionarily conserved function in development of the skeleton and its precursor structures. It could be shown, that this molecular machinery, which is essential for skeletogenesis, is also present in cephalochordates and not only in vertebrates and is thus approximately 100 million years older than previously thought.