Molekulare, evolutionäre und klinische Charakterisierung eines CpG- Mikrosatelliten-bindenden Transkriptionsfaktorkomplexes und seines polymorphen cis-Elements

Abstract

Das Endothelin-Konvertierungsenzym-1 (ECE-1) ist das Schlüsselenzym der Endothelinbiosynthese und damit an zahlreichen (patho-)physiologischen Vorgängen wie Entwicklung des Herz-Kreislauf- und Magen-Darm-Systems, Bluthochdruck oder Kardiomyopathie beteiligt. In mehreren Arbeiten konnte auch gezeigt werden, dass ECE-1c zu den Enzymen gehört, welche in vitro und in vivo Amyloid-Plaques, neben den Tau-Fibrillen das pathologische Hauptkorrelat der Alzheimer-Demenz, abbauen können. Durch alternatives Splicen und Vorliegen alternativer Promotoren existieren mindestens vier ECE-1-Isoformen. Während für ECE-1b bereits ein Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) mit Einfluss auf die präfrontale ECE-1 mRNA-Expression und einem erhöhten Risiko eine Alzheimer-Demenz zu entwickeln gezeigt werden konnte, ist die Hauptisoform, ECE-1c, diesbezüglich noch weitestgehend unerforscht. In Vorarbeiten konnte ein polymorpher [CpG]m-[CA]n-Mikrosatelliten-repeat im Promotor des humanen ECE-1c mit Nachweis einer in vitro-Funktionalität identifiziert werden. Ferner wurden mittels rapid amplification of cDNA ends (RACE) und genomischem RNase protection assay (RPA) Transkriptionsstartpunkte innerhalb des Mikrosatelliten entdeckt. Darauf basierend lag das Ziel dieser Arbeit zum einen in der molekulargenetischen und funktionellen Charakterisierung des [CpG]m-[CA]n -Mikrosatelliten-repeat sowie Identifikation bindender Transkriptionsfaktoren und zum anderen in der klinischen Assoziation zur Alzheimer-Demenz. Durch Klonierung serieller Deletionsmutanten des ECE-1c-Promotors mit und ohne den [CpG]m-[CA]n-Mikrosatelliten-repeat von 35 verschiedenen humanen Haplotypen, Transfektion und anschließender Aktivitätsmessung im Luziferase-Reportergen- Assay konnte eine Funktionalität in Abhängigkeit des [CpG]m-[CA]n -Mikrosatelliten-repeat nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden mit Hilfe von DNA-Affinitätschromatographie unter Verwendung größenfraktionierter Kernproteine, electromobility shift assay (EMSA) und Massenspektrometrie Poly (ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) und splicing factor proline- and glutamine- rich (SFPQ) als bindende Transkriptionsfaktoren identifiziert. Für SFPQ konnte die Bindung mittels sogenannter supershift-Analyse und für PARP-1 mittels radioaktiv markiertem Protein im EMSA bestätigt werden. Die Funktionalität beider Faktoren wurde im Luziferase-Reportergen-Assay durch Transfektion oben beschriebener serieller Deletionsmutanten in PARP-knockout-Zellen sowie unter Überexpression von PARP-1 und/ oder SFPQ nachgewiesen. In einer klinischen Assoziationsstudie wurde die [CpG]m-[CA]n-repeat-Länge von 403 Patienten und 444 nicht dementen Kontrollpersonen mittels fluoreszenzmarkierter Polymerasekettenreaktion (PCR) und zum Teil durch Sequenzierung genotypisiert. Statistisch konnte ein signifikanter Unterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Zudem wurde auch der [CpG]m-[CA]n -Mikrosatelliten-repeat von sechs Schimpansen untersucht. Auch bei Schimpansen ist der repeat polymorph, jedoch deutlich kürzer als bei Menschen. Zudem ließ sich im Luziferase-Reportergen-Assay – im Gegensatz zu den menschlichen Haplotypen – keine Aktivitätsänderung durch den repeat nachweisen. Somit zeigt diese Arbeit, dass der [CpG]m-[CA]n-Mikrosatelliten-repeat hochpolymorph und funktionell ist, die Proteine PARP-1 und SFPQ als Transkriptionsfaktoren auf dem repeat binden und es einen signifikanten Unterschied der repeat- Komposition zwischen Alzheimerpatienten und nicht dementen Patienten gibt.

Endothelin-converting enzyme -1 (ECE-1) is the key enzyme of endothelin biosynthesis and is involved in various cardiovascular (patho)physiologies. Furthermore, it has been demonstrated that ECE-1c is able to degrade amyloid plaques, one pathologic hallmark of Alzheimer's disease (AD), in vitro and in vivo. At least four isoforms of ECE-1 are generated by alternative splicing and existence of alternative promoters. While a single nucleotide polymorphism in the ECE-1b isoform-specific promoter with influence on the prefrontal ECE-1 mRNA-expression and on the likelihood of developing AD has already been described, a potential link between AD and ECE-1c, the main isoform, is still unexplored. In previous experiments, a polymorphic [CpG]m-[CA]n microsatellite repeat in the human ECE-1c promoter has been identified and its functionality in vitro has been demonstrated. Furthermore, transcriptional start sites within the microsatellite could be detected by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and genomic RNase protection assay (RPA). On the one hand, the aim of this work was to characterise the [CpG]m-[CA]n microsatellite repeat as well as to identify binding transcription factors, and on the other hand to look for a clinical association to AD. By subcloning serial deletion mutants of the ECE-1c promoter of 35 different human haplotypes with and without the microsatellite repeat, transfection and subsequent luciferase reporter gene assays, the repeat's influence on the promoter activity was demonstrated. In addition, poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) and splicing factor proline- and glutamine-rich (SFPQ) were identified as binding transcription factors via DNA affinity chromatography, electromobility shift assay (EMSA) and mass spectometry. The binding of SFPQ was confirmed by so-called supershift analysis, the binding of PARP-1 by EMSA using radioactively labelled proteins. The functionality of both factors was shown in the luciferase reporter gene assay using PARP knockout cells and overexpression of PARP-1 and/ or SFPQ. In a clinical study, the repeat of 403 patients and 444 non demented controls was genotyped via fluorescent-labeled genomic polymerase chain reaction (PCR) and in some cases additionally via sequencing. A statistical significant difference between patients and controls was found. Finally, the [CpG]m-[CA]n microsatellite repeat of six chimpanzees was examined showing that the repeat is shorter than in humans and without effect on promoter activity. In summary, this work depicts that the [CpG]m-[CA]n microsatellite repeat is highly polymorphic and functional, that PARP-1 and SFPQ are binding as transcription factors and that there is a significant difference in repeat composition between AD and controls.