Pharmacological unmasking of epigenetically regulated genes in renal cell carcinomas under clinical chemistry aspects

Abstract

Transcriptional silencing associated with aberrant promotor methylation is acknowledged as a common mechanism for loss of function of tumor suppressor genes in cancer cells. This thesis describes an epigenetic screen aimed to discover hitherto unkown genes that are silenced by this mechanism in kidney cancer. Reexpressed genes were analyzed in the kidney cancer cell line A-498 after treatment with the DNA methyltransferase (DNMT) inhibitor zebularine. Transcript expression changes in treated and untreated cells were compared using Affymetrix GeneChip® Human genome U133A 2.0 Arrays. For candidate selection we applied criteria like the presence of CpG islands and SAGE- database derived expression data. 308 transcripts were shown to be upregualted ≥ 1.5-fold after the combination of three individual experiments. We also included experiments to show the efficacy of the demethylation treatment. Eight candidates were further investigated for their hypothesized downregulation in 49 patient RCC tumor tissues. A significant downregulation for three members of the metallothioneins was detected, with an overall percentage of 98% in cases for both MT1G and MT1H, and 73% for MT2A. We could not demonstrate a statistical significant correlation of this downregulation to clinicopathological characteristics like tumor stage and grade. At least we found a tendency for a positive correlation between MT2A expression and grading. In addition we found a tendency for negative correlation between MT1G expression and tumor staging. 83 Summary/Zusammenfassung We deposited the results of our RNA chip analysis to the Geo-database (accession code GSE51627) and compared our initial 308 transcript list to publicly available data. This comparison revealed a shared number of well-known kidney cancer genes that points to a high specificity of the underlying demethylating process no matter which demethylating drug was used and speaks for the consistency of our experimental apporach.

Transkriptionsinaktivierung vorgerufen durch eine veränderte Promotormethylierung ist ein akzeptierter Mechanismus für den Funktionsverlust von Tumorsuppressorgenen. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein epigenetisches Screening-Verfahren zu Entdeckung bislang unbekannte Gene beim Nierenzellkarzinom, die durch diesen Mekanismus inaktiviert wurden. Wir untersuchten reaktivierte Gene nach der Behandlung der Nierenzellkarzinom- Zelllinie A-498 mit den DNA methyltransferase (DNMT) Inhibitor Zebularine. Expressionsveränderungen in behandelten und unbehandelten Zellen wurden durch den Einsatz von Affymetrix GeneChip® Human genome U133A 2.0 Arrays analysiert. Für die Kandidatenselektion wurden Kriterien wie das Vorhandensein von CpG Inseln und Expressionsdaten der SAGE-Datenbank verwendet. 308 Transkripte waren nach der kombinierten Analyse von drei Einzelexperimeten mehr als 1.5-fach hochreguliert. In zusätzlichen Experimenten wurde die Wirksamkeit der Demethylierung durch Zebularine untersucht. Acht Kandidaten wurden für den Nachweis eine veringerten Expression entsprechend unsere Arbeithypothese in 49 Tumorgeweben von Nierenzellkarzinom- Tumorpatienten weiter analysiert. Wir fanden ein signifikant veringerte Expression für drei Metallothionein-Gene in 98% aller Fälle für MT1G und MT1H, und 73% aller Fälle für MT2A. Wir konnten keine statistische signifikante Korrelation dieser verminderte Expression mit klinish-pathologischen Eigenschaften wie dem Tumorstadium und dem Tumorgrad nachweisen. Wir fanden eine Tendenz für eine positive Korrelation zwischen der MT2A Expression und dem Tumorgrad, so wie eine Tendenz zur negativen Korrelation der MT1G expression mit dem Tumorstadium. Die Resultate der RNA Chip-Analysen wurden and die Geo-Datenbank übermittelt (accession code GSE51627). Die Liste der 308 Transkripte wurde mit öffentlich zugänglichen Daten verglichen. Dieser Vergleich ergab Übereinstimmungen mit bekannten Nierenzellkarzinom-Genen, die auf eine hohe Spezifität des zugrunde liegenden Demethylierungs-Verfahrens schließen lassen, was nicht zuletzt für die Konsistenz des experimentallen Vorgehens spricht.