Synthese und pharmakologische Testung von NSAR-Zeise-Komplexen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Synthese und biochemische Testung von NSAR-Zeise- Verbindungen. Ausgangspunkt war die Entdeckung, dass das Zeise-Salz die Fähigkeit besitzt, beide Isoformen der Cylooxygenase in beträchtlichem Umfang zu hemmen. Durch Austausch des Ethens gegen unselektive NSAR und selektive COX-2-Hemmer sollten Platinkomplexe erhalten werden, die durch ihren Liganden eine Selektivität für eines der beiden Isoenzyme vermittelt bekommen. Die Synthese erfolgte dabei in 2 Schritten. Zunächst wurden bekannte NSAR an ihrer Säurefunktion mit einer olefinischen Seitenkette derivatisiert. Danach konnte das Platin an die eingeführte Doppelbindung komplexiert werden. Wie schon oben erwähnt, wurde das Zeise-Salz als Inhibitor von sowohl COX-1 als auch COX-2 im Arbeitskreis entdeckt. Bisher sind keine Platinkomplexe als COX-Inhibitoren in der Literatur beschrieben. Die Testung anderer Platinkomplexe, wie z.B. Cisplatin oder Kaliumtetrachloroplatinat, zeigte keine hemmenden Fähigkeiten. Das ließ auf einen spezifischen Hemmmechanismus des Zeise-Salzes schließen. Um die Ursache der COX-Hemmung zu finden, wurden in Kooperation mit der Uni Bochum LC-MS-Untersuchungen durchgeführt. Dazu wurde die COX-1 mit dem Zeise- Salz inkubiert und anschließend enzymatisch verdaut. Durch Auftrennung der Peptidfragmente durch RP-HPLC und Detektion mittels MS/MS konnten platinierte Aminosäuren unter Angabe der Koordinationsstelle am Enzym gefunden werden. Dabei handelte es sich bei einer der platinierten Aminosäuren um das Tyrosin385. Diese Aminosäure befindet sich im aktiven Zentrum und ist essentiell für die Bindung der Arachidonsäure in der Bindungstasche der COX. Die Platinierung an dieser Stelle dient daher sehr gut als Erklärung für die resultierende Hemmung des Enzyms in Gegenwart von Zeise-Salz. Um den Effekt auf die Cyclooxygenasen zu untersuchen, wurden die synthetisierten Platinverbindungen zunächst an isolierten Enzymen getestet. Bei allen getesteten Patinkomplexen wurde eine Präferenz für die COX-1 erhalten. Damit im Einklang stehen die geringen antiproliferativen Effekte aller NSAR-Zeise- Komplexe, die im Kristallviolettassay an MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen ermittelt wurden. An isolierter DNA zeigen die Komplexe hervorragende Bindungseigenschaften. Die ermittelten IC50-Werte liegen bei keinem der getesteten NSAR-Zeise-Komplexe unterhalb von 10µM. Daher wurde analog zur COX- Hemmung auch das DNA-Bindungsvermögen unter zellulären Bedingungen untersucht. Nach Isolierung der DNA aus mit NSAR-Zeise-Komplexen inkubierten MCF-7-Zellen, konnte dort nur wenig gebundenes Platin nachgewiesen werden. Um eine Erklärung der schlechten pharmakologischen Eigenschaften unter zellulären Bedingungen gegenüber den hervorragenden Eigenschaften an den isolierten Targets zu finden, wurde zum einen die Zell- und Zellkernaufnahme der Komplexe und zum anderen die Reaktion mit Proteinen untersucht.

This thesis deals with synthesis and biochemistry of NSAID-Zeise complexes. Starting point was the discovery that Zeise salt has the ability to inhibit both isoforms of Cylooxygenase. Through exchange of ethene to nonselective NSAIDs and selective COX-2 inhibitors platinum complexes should be obtained, showing a selectivity for one of the two isoenzymes. The synthesis was carried out in two steps. Initially known NSAIDs were derivatized at their acid function with an olefinic side chain. Then the platinum was linked to the double bond. As mentioned above, the Zeise salt was detected as an inhibitor of both COX-1 and COX-2. Descriptions of platinum complexes as a COX- inhibitors could not be found. Testing other platinum complexes, e.g. Cisplatin or potassium tetrachloroplatinate showed no inhibitory ability. This indicates a specific mechanism of inhibition of Zeise salt. Therfore the COX-1 was incubated with Zeise salt and then digested enzymatically. By separating the peptide fragments by RP-HPLC and detection by MS/MS we found platinized amino acids. Interestingly one of the platinated amino acids was Tyrosine385. This amino acid is located in the active site of COX and essential for the binding of arachidonic acid. This fact provides a good explanation for resulting inhibition of the enzyme in presence of Zeise salt. To investigate the effect on the cyclooxygenases, the platinum compounds were first tested on isolated enzymes. All synthezised complexes showed preference for COX-1. DNA- and protein-binding studies showed that NSAID-Zeise complexes can react readily with biomolecules. This promises good cytotoxic effects on cancer cells via their DNA-binding ability. But none of the tested NSAID-Zeise complexes showed IC50 values below 10µM on MCF-7- an MDA-MB-231 cells. Based on these results the study of DNA-binding was repeated under cellular conditions. After isolation of DNA from nuclei of MCF-7 cells there was only a little amount of platinum bound to DNA. To find an explanation of the poor pharmacological properties under cellular conditions with respect to the outstanding properties of the isolated targets, investigations on cellular uptake, uptake by nuclei and protein binding were carried out.