Hepatozyten und hepatische Progenitorzellen − Isolierung und Charakterisierung aus humanem, explantiertem Lebergewebe mit dem Ziel der Zelltransplantation

Abstract

Das Forschungsprojekt des Neohybriden Lebertransplantates verfolgt das Ziel, die beiden Therapieformen der Lebertransplantation und Leberzelltransplantation miteinander zu verbinden. Durch ein in vivo Tissue- Engineering soll eine operationale Toleranz, das heißt das Ausbleiben einer schädigenden, immunologischen Reaktion gegenüber der Spenderleber, induziert werden. Die Grundidee beruht auf einer nach der Organtransplantation durchgeführten Zelltransplantation mit autologen Hepatozyten, welche anschließend die Spenderleber besiedeln. Auf diese Weise soll der Bedarf an immunsuppressiven Medikamenten nach der Lebertransplantation gesenkt werden. Hierfür sollten funktionale Hepatozyten und Leberzellvorläufer aus dem explantierten, hochgradig pathologisch verändertem Lebergewebe der Organspendeempfänger gewonnen und auf ihre Eignung für die Zelltransplantation geprüft werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Ergebnisse der Zellisolierung aus 23 erkrankten, explantierten Lebern und 14 Leberteilresektaten aus unverändertem Lebergewebe von menschlichen Patienten miteinander verglichen. Die Hepatozyten wurden in Kultur auf ihre Viabilität und metabolische Aktivität getestet und zudem einer Kühllagerung über bis zu 48 Stunden unterzogen. Die Nichtparenchymale Zellfraktion wurde mittels Durchflusszytometrie charakterisiert und zwei Anreicherungsmethoden für Leberzellvorläufer getestet. Zudem wurde ein neuartiges Mausmodell entwickelt, mit dem nachfolgend die Eignung der Hepatozyten aus explantiertem Lebergewebe für die Zelltransplantation geprüft werden soll. Trotz des jeweils klinisch manifesten Leberversagens, welches die Durchführung einer Lebertransplantation notwendig machte, konnten aus den explantierten Lebern funktionale Hepatozyten isoliert und kultiviert werden. Die Isolierungsergebnisse unterschieden sich dabei nicht signifikant von denen aus unverändertem Lebergewebe. Auch bezüglich ihrer Viabilität und metabolischen Aktivität in der Zellkultur waren die Unterschiede zwischen den Hepatozyten aus erkrankter, explantierter Leber und dem unveränderten Gewebe der Leberteilresektate gering. Tatsächlich gab es sogar Anhaltspunkte, dass die Zellen aus erkranktem Lebergewebe in der Langzeitkultur stabiler sind. Die Kühllagerung der isolierten Hepatozyten über 24 und 48 Stunden konnte mit akzeptablen Verlusten der Zellviabilität durchgeführt werden. Die beiden getesteten Lagerungsmedien ChillProtec® und ChillProtec® plus unterschieden sich dabei nur geringfügig. Auch hier gab es Hinweise auf eine bessere Stabilität der Hepatozyten aus erkranktem, explantiertem Lebergewebe. Die Nichtparenchymale Zellfraktion wurde zunächst auf das Vorhandensein des Glykoproteins EpCAM, einem bekannten Oberflächenmarker für hepatische Progenitorzellen, und auf den Leukozytenmarker CD45 überprüft. Die Nichtparenchymale Zellfraktion erkrankter, explantierter Lebern enthielt dabei tendentiell mehr EpCAM- positive Zellen als die der Leberteilresektate. Dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant. Im Rahmen weiterer Färbungen erwiesen sich die EpCAM-positiven Zellen zugleich als CD133/1-positiv, was die Annahme unterstützt, dass es sich dabei um potentielle Leberzellvorläufer handelte. Die EpCAM- und CD45-negative Zellfraktion, welche etwa die Hälfte der Nichtparenchymalen Zellfraktion ausmachte, enthielt bei erkrankten, explantieren Lebern signifikant mehr CD90-positive Zellen als bei Leberteilresektaten. Auch CD90 gilt als Marker für hepatische Progenitorzellen, so dass es sich bei diesen Zellen ebenfalls um potentielle Vorläufer für Hepato- und Cholangiozyten handelte. Die anschließend getesteten Anreicherungsverfahren mittels OptiPrep™-Dichtegradientenzentrifugation und Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS®) zur Gewinnung von Leberzellvorläufern für die Zelltransplantation erwiesen sich als ungeeignet. Mit dem neuartigen, für das Projekt optimierten Mausmodell ließen sich erfolgreich humane Hepatozyten aus Leberteilresektaten in der Mausleber ansiedeln. Es stellte sich heraus, dass die Viabilität der zu transplantierenden Zellen offensichtlich eine wichtige Rolle für den Repopularisierungserfolg spielt. Zudem wurden Fehlerquellen bei der Durchführung und Auswertung des Modells identifiziert, um dessen geplante Anwendung für Zellen aus explantierter Leber zu optimieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen die These, dass Hepatozyten aus erkranktem, explantiertem Lebergewebe für die Verwendung bei der Hepatozytentransplantation geeignet sein könnten. Es gab deutliche Hinweise dafür, dass aus hochgradig erkrankter Leber eine ausreichende Anzahl an Leberzellvorläufern für die Zelltransplantation isoliert werden kann. Beide Zelltypen müssen nun auf ihre repopulativen Eigenschaften hin untersucht werden, wofür sich das hier etablierte Mausmodell als geeignet erwies. Mit Hilfe des Projektes „Neohybrides Lebertransplantat“ soll lebertransplantierten Menschen eine längere Überlebenszeit bei höherer Lebensqualität gewährleistet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Aussichten auf eine Realisierung dieses Projektes.

The basic idea of the Neo-Hybrid Liver Graft project is to combine the two therapeutic options of liver transplantation and liver cell transplantation. The final objective is to develop a new concept of in vivo tissue engeneering of the liver by performing a cell transplantation of autologous hepatocytes after an orthotopic liver transplantation has been conducted. This is anticipated to induce a partial or complete absence of detrimental immune response towards the allogeneic liver graft, called operational tolerance, and consequently reduce the need for immunosuppressants. For this purpose functional hepatocytes and hepatic progenitor cells from explanted, diseased human livers were isolated and examined with regard to their suitability for cell transplantation. Hepatocyte isolations from sections of 23 explanted diseased human livers were carried out and compared to the results of 14 isolations from normal liver tissue after partial hepatectomy. The hepatocytes were cultured and examined for their viability and metabolic activity. Additionally, the cells were stored at 4°C for up to 48 hours to analyze stability during cold storage. The non parenchymal cell fraction was characterized by flow cytometry and two methods for liver progenitor cell enrichment were tested. Furthermore, a new mouse model of liver cell transplantation was developed with the intent to later test the repopulative capacity of hepatocytes from diseased, explanted liver tissue. Despite of a clinically confirmed liver failure as an indication of orthotopic liver transplantation, fully functional hepatocytes from explanted liver tissue could be successfully isolated and cultivated. Moreover, no significant difference to the isolation outcome of healthy liver tissue could be found. In hepatocyte cultures only minor differences in viability and metabolic activity could be observed between cells from diseased and healthy liver tissue. Indeed, hepatocytes from diseased, explanted liver tissue appeared to be more robust in long term culture. The cold storage of hepatocytes for 24 and 48 hours resulted in acceptable losses of cell viability, which differed only slightly between the two tested storage media ChillProtec® and ChillProtec® plus. Again, hepatocytes from diseased liver tended to be more robust than those from healthy liver tissue. The non parenchymal cell fractions were initially tested for the cell surface protein EpCAM, a known marker of hepatic progenitor cells, and for the leucocyte marker CD45. The non parenchymal cell fraction of diseased, explanted liver tissue contained more EpCAM-positive cells than those obtained from partial liver resections. However, these differences were not statistically significant. The majority of EpCAM-positive cells turned out to be also positive for the surface marker CD133/1, confirming the phenotype of progenitor cells. Making up about half of the non parenchymal cells the EpCAM- and CD45-negative cell fraction of diseased, explanted livers contained significantly more CD90-positive cells than those of partial liver resections. These cells also represented potential progenitors of hepato- or cholangiocytes as CD90 has been repeatedly described as a marker of hepatic progenitor cells. Subsequent enrichment of these potential progenitor cells for immediate cell transplantation by the means of OptiPrep™ density gradient centrifugation or magnetic-activated cell sorting (MACS®) proved to be inappropriate. The new mouse model for liver cell transplantation, which had been optimized to fit this project, showed successful engraftment of human hepatocytes isolated from normal tissue of partial liver resections. Above all, the viability of cells at the time of transplantation turned out to play an important role for successful engraftment. Potential sources of error during execution and analysis of the model have been assessed in order to optimize its scheduled application with hepatocytes from diseased, explanted liver. Altogether, the results presented here support the hypothesis that hepatocytes from diseased, explanted human livers represent an adequate cell source for hepatocyte transplantation. Moreover, there was evidence that a sufficient number of hepatic progenitor cells can be isolated from diseased liver for cell transplantation. Both cell types now need to be tested for their repopulative capacity using the newly developed mouse model. The Neo-Hybrid Liver Graft project aims to extend survival time and improve quality of life of people undergoing orthotopic liver transplantation. The hereby presented results support the feasibility of the concept.