Bakterielle Permeation und eptheliale Barriereveränderungen bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Abstract

Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wurden im Vergleich mit gesunden Darm von Patienten einer Kontrollgruppe hinsichtlich ihrer Durchlässigkeit für einen enterotoxinbildenen Bacteroides fragilis im menschlichen Darm im in- vitro-ex-vivo Versuch mit der Ussingkammer untersucht. Anschließend erfolgte eine quantitative Erfassung der Permeation. Eine Korrelation zwischen Permeation und Entzündungsmuster sowie klinisch relevante Faktoren, die eine Permeation begünstigen könnten, wurde erörtert. Der Nachweis der Toxinbildung für den verwendeten Keim erfolgte über einen Zytotoxizitätsessay. Der totale Widerstand wurde nach Inkubation bei 3 HT 29/B7-Monolayer-Gruppen gemessen. Es wurden der Versuchskeim, ein nicht Toxin bildender Laborstamm und ein bakterienfreier Ansatz miteinander verglichen. Es zeigte sich eine Abnahme des totalen Widerstands von 20,2 auf 9,3 cm2 für den verwendeten Ampicillin/Sulbactam resistenten Wildstamm. Somit wurde der Nachweis von Riegler et al. 199997 bestätigt, dass die Zugabe des Bacteroides-Toxins zu einer Abnahme des totalen Widerstands in der Zellkultur und am humanen Colon führt. Der Zytotoxizitätsessay war der Beweis für das Vorhandensein des Bacteroides fragilis Toxin. Eine definierte Menge von Ampicillin und Sulbactam resistenten Bacteroides fragiles im Mittel 250 KBE/100µl, wurde der mucosaseitigen Hälfte der Badlösung in der Ussingkammer zugegeben. Um eine Permeation nachzuweisen wurden serosaseitige Proben der Badlösung entnommen, auf eine Agarplatte gebracht und 48 Stunden inkubiert. Durch Auszählen der gewachsenen koloniebildenen Einheiten erfolgte der Nachweis der permeierten enterotoxinbildenen Bacteroidaceae fragiles. Zur selektiven Anzucht von Bacteroides fragiles wurde zur Wachstumshemmung weiterer Enterobakterien der Darmflora, der Badlösung und der Agarplatten zusätzlich Kanamycin, Vancomycin, Ampicillin und Sulbactam hinzugefügt. In der Morbus Crohn- und in der Colitis ulcerosa Gruppe bestand im Vergleich zu der Kontrollgruppe insgesamt eine gering erhöhte Permeabilität für Bacteroides fragiles. Im Ileum des Morbus Crohn ergab sich in 1 von 14 Präparaten = 7,2%, bei der Colitis ulcerosa in 4 von 9 Präparaten = 44,4% und in der Kontroll-Gruppe keine Permeation des Bacteroides fragilis.Im Colon von Patienten mit Morbus Crohns zeigte sich in 3 von 13 Präparaten = 23.1%, bei der Colitis ulcerosa in 2 von 11 Präparaten = 18.2% und in der Kontrollgruppe in 1 von 16 Präparaten = 6.2% eine Permeation. Dabei erreichen weder die Permeationsrate der Ileum- und der Colonepithelien bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, im Vergleich zu den Kontrollen das Signifikanz-Niveau. Während des gesamten Versuchszeitraumes von 180 Minuten waren alle totalen elektrischen Widerstände der Epithelien bei allen Versuchen der jeweiligen drei Gruppen stabil geblieben. Die Intaktheit des Epithels wurde über den Versuchszeitraum über die Stabilität des elektrischen Widerstands des Epithels elektrophysiologisch belegt. Die Ileum- und Colon- Widerstände der Morbus Crohn Gruppe zeigten keine Verminderung gegenüber den Kontrollen. Zwischen bakterieller Permeation und Widerstand des Epithels ließ sich kein Zusammenhang aufzeigen. Die Zahl der serosal nachgewiesenen Bakterien und die gemessenen elektrischen Widerstände korrelierten nicht miteinander (r = 0,138 ). Bei der Colitis ulcerosa zeigte sich gegenüber Morbus Crohn eine Verminderung des Ileum – Widerstandes. Es gab keinen Zusammenhang zwischen bakterieller Permeation und Widerstand des Epithels. Eine Korrelation zwischen der Zahl der serosal nachgewiesenen Bakterien und den gemessenen elektrischen Widerständen (r = 0,314 , p= 0,411) bestand nicht. Weder für den Morbus Crohn, noch für die Colitis ulcerosa konnte eine Korrelation zwischen klinischen Parametern und bakterieller Permeation gefunden werden. Die geringe Permeationsrate, vor allem unter dem Aspekt, dass sich auch bei den Kontroll Patienten eine Permeation finden lässt, könnte Teil einer natürlichen bateriellen Translokation sein. Diese Ergebnisse machen vielmehr eine bakterielle Permeation als physiologische Auseinandersetzung des Immunsystems mit Bakterien wahrscheinlich. Es besteht also bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Vergleich zu darmgesunden Patienten keine erhöhte Permeabilität für Bacteroides fragiles. Hierfür kommen verschiedene mögliche Erklärungen in Betracht: Entweder reicht die Toxin-Produktion des verwendeten Stammes nicht aus, oder die Toxinwirkung wirkt sich nicht auf die Barrierefunktion des Colons aus. Ebenso könnte man eine in-vitro-Erkennung der Toxinwirkung nur durch eine isolierte Toxinzugabe, wie in den Versuchen von Obiso et al.199789 beschrieben, in Erwägung ziehen. Die niedrige Permeationsrate könnte auf die erhöhte Adhärenz des Bakteriums an die Mucosa über die Adhärenz von Fragilysin an Adhäsionsproteinen zurückzuführen sein. Dies könnte zu einer Veränderung der Epithelbarrierefunktion führen. Zusätzlich wird die Hydrolysefähigkeit des Fragilysin diskutiert, die zur Veränderung der mukosalen Mucinschicht und zur Veränderung des Zytoskelettes führt. Zudem kann man die Stimulierung der Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen sowie ein Ungleichgewicht von pro und anti inflammatorischen Zytokinen als Auslöser des hyperaktivierten darmassoziierten Immunsystems betrachten. Eine Veränderung der epithelialen Polarität durch die Zerspaltung von Adhäsionsmolekülen führt über die verstärkte Adhärenz zu einer verminderten bakteriellen Permeation. Die geringe Permeationsrate des Bacteroides fragilis könnte sich somit durch die erhöhte Adhärenz und die einzelne Wirkung der Virulenzfaktoren von Fragilysin an der Mucosa begründen. Es erübrigt sich eine weitere spekulative Diskussion zur Erklärung der geringeren Permeationsrate. Bacteroides fragilis eignet sich nicht in diesem in-vitro-ex-vivo-Modell. Die normale Darmflora ist ein komplexes Ökosystem, das bis heute unzureichend verstanden ist. Gleichwohl weiss man heute, dass die normale Darmflora sowohl nützliche als auch negative krankheitsauslösende Effekte für den Wirt haben kann. Es ist zu erwarten, dass in den nächsten Jahren durch molekulare Analysen der Bakterien-Bakterien- sowie Bakterien-Wirt – Interaktionen die einzelnen Komponenten der Darmflora besser verstanden und somit die Grundlagen für neue therapeutische Ansätze geschaffen werden könnten.

The present study was carried out to establish a method of bacterial permeation through human intestinal gut ex vivo. Assuming that the inflammed epithelial layer exhibits barrier defects in chronic inflammatory bowel disease, we accomplished our research. In the study under consideration, we demonstrated the bacterial permeation in human intestinal gut layer ex vivo for the first time. Concerning the lowely rate of permeation we examine the miscellaneous causes: A modification of the epithel barrier layer was caused by Fragilysin of Bacteroides fragiles by the adherence of adhesions proteins. In addition, Fragilysin had a positive toxic effect on the cytoscelton and morhphology on HT 29 intestinal cells. Caused by the hydolysis of BFT, the G and F actin proteins, which are connected to the cytoscelton are changed. Thus resulting in a new modification of the cytoscelton of the epithel cells. Therefore the epithel cells could change their task of an effective epithelial barrier ( Saidi, et al. 1997 ²).The above mentioned outcome could result in an alleviation of bacterial permeation for additional intestinal bacterias. The permeation rate of chron’s disease and colitis ulcerative in comparison to the controlls, did not reached the significance niveau. Neither with crohn’s disease, nor with colitis ulcerative, there was no correlation between permeation and grade of activity of the inflammation. The model developed during this study is not able to verify the bacterial permeation in chronis inflammatory bowel disease. However the above mentioned method could be used in testing the influence of different substances ( i.e. pharmaceuticals) in regard of permeation in the ussing chamber, as well as testing the metabolism on inflammed epithel cell layer in patient with chronic inflammatory bowel disease.