Biochemische und funktionelle Charakterisierung der G-Protein-Isoform β5

Abstract

Die heterotrimeren G-Proteine bestehen aus alpha, beta und gamma Untereinheiten und vermitteln die Signalübertragung von transmembranalen Rezeptoren auf intrazelluläre Effektoren. Die Signalübertragung erfolgt über die Aktivierung des G-Proteinkomplexes, wobei die Galpha-Untereinheit vom Gbetagamma-Komplex dissoziiert. Der Gbetagamma-Komplex dissoziiert nicht und fungiert als funktionelles Monomer. Die Gbeta-Untereinheiten 1-4 sind stark konserviert und weisen auf Aminosäureebene eine Homologie von 79-90% auf. Die zuletzt identifizierte, fünfte Gbeta-Untereinheit weist dagegen in der Primärstruktur nur ca. 50% Übereinstimmung zu den anderen Gbeta-Isoformen auf. Im Hinblick auf diese Divergenz wurde das potenzielle Spektrum der Interaktionen des Gbeta5-Proteins biochemisch und funktionell charakterisiert. Durch Koexpressionsexperimente konnte zunächst gezeigt werden, dass G-Protein beta5 typische funktionelle Eigenschaften einer Gbeta-Untereinheit aufweist. Es bildet einen funktionellen Komplex mit Galphai1 und Ggamma-Untereinheiten und aktiviert im Komplex mit Ggamma2 einen typischen Gbetagamma-sensitiven Effektor, PLCbeta2. Im Gegensatz zum klassischen Gbetagamma-Dimer können Gbeta5gamma-Heterodimere weiter dissoziieren. Nach der Dissoziation bleiben Gbeta5 und Ggamma stabil und löslich. Durch Gelfiltrationsanalyse wurde gezeigt, dass die Ggamma-freie Gbeta5-Untereinheit in einer monomeren globulären Konformation vorliegt. Des weiteren können dissoziierte Untereinheiten zu einem funktionellen Gbeta5gamma-Heterodimer reassoziieren. Die bislang nicht beobachtete reversible Dissoziation scheint unter allen Gbetagamma-Komplexen nur auf Gbeta5gamma-Dimere beschränkt zu sein. Damit übereinstimmend wurde mittels einer Ggamma2-Affinitätssäule das G-Protein beta5, jedoch nicht Gbeta1-4, aus Hirnlysaten isoliert. Durch eine mehrstufige chromatographische Aufreinigung von Gbeta5-haltigen Komplexen aus dem Gehirn konnten bereits publizierte Beobachtungen bestätigt werden, wonach Gbeta5 im neuralen Gewebe mit RGS-Proteinen der R7 Subfamilie assoziiert vorkommt. Weiterhin konnte mittels Koisolations- sowie Rekonstitutionsansätzen zum ersten Mal eine Dissoziierbarkeit sowohl aus dem Gewebe gereinigter als auch rekombinanter Gbeta5/RGS6- bzw. Gbeta5/RGS7-Komplexe demonstriert werden. Dabei konkuriert die Ggamma2-Untereinheit mit RGS6- bzw. RGS7-Proteinen um die Bindung an Gbeta5. Zusammenfassend lässt sich die Dissoziierbarkeit als eine grundsätzliche und spezifische Eigenschaft der Gbeta5-haltigen Komplexen feststellen, die dynamische Wechselwirkungen des G-Proteins beta5 mit verschiedenen Molekülen ermöglicht. Diese Eigenschaft weist auf einen putativen Mechanismus in der Gbeta5-abhängigen Signaltransduktion hin.

Heterotrimeric G-proteins consisting of an alpha, beta and gamma subunit transduce extracellular signals received by transmembrane receptors to intracellular effector proteins. Activation of the G-protein leads to release of GTP-bound Galpha from the Gbetagamma complex, both of which modulate the downstream effectors. Gbeta and Ggamma subunits remain tightly associated to each other and act functionally as a monomer. While Gbeta1-4 subunits display a high degree of identity of their amino acid sequences (79-90%), the Gbeta5 subunit exhibits much less homology with other family members (53% identity). This structural divergence has given rise for the analysis of biochemical and functional properties of the Gbeta5 protein in order to define the potential range of its interaction. In the present study copurification experiments indicate that Gbeta5, like Gbeta1-4, forms a heterotrimeric Galphai1beta5gamma complex. Futhermore, a Gbeta5gamma2 dimer is able to activate a Gbetagamma effector, PLCbeta2. In contrast to tightly associated canonical Gbetagamma- dimer Gbeta5gamma complexes dissplay the ability to dissociate. Upon dissociation, Gbeta5 and Ggamma remain stable and soluble. Gel filtration chromatography reveals that Gbeta is a monomeric globular protein. Futhermore, purified Gbeta5 and Ggamma2 subunits reassociates to a functionally active dimer. In agreement with this observation Gbeta5, but not Gbeta1-4, was isolated from bovine brain lysate, using a Ggamma2 affinity column. Purification of Gbeta5 containing complexes from cytosolic fraction of bovine brain confirms that Gbeta5 is associated with RGS proteins of R7 subfamily. Further analysis of native and recombinant Gbeta5/RGS6 and Gbeta5/RGS7 demonstrated, that Ggamma2 competes with RGS6 and RGS7 proteins for binding to Gbeta5. The unique feature of Gbeta5 to reassociate with its partners points to a novel putative mechanism in the regulation of Gbeta5 dependent signal transduction.