Molecular and functional typing of isolates of the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex with emphasis on multi-drug resistant Acinetobacter baumannii

Abstract

Antimicrobial resistance in bacteria is an ancient phenomenon that emerged as a serious threat to humans and animals within only the last few decades. Nowadays, multi-drug resistant bacteria cause severe diseases in humans as well as animals worldwide, leaving few therapeutic options. Among these, Acinetobacter (A.) baumannii is of increasing importance, especially with regard to the epidemic clonal lineages IC I-III, which are particularly associated with carbapenem and multi-drug resistance. Moreover, these clonal lineages could already be detected among A. baumannii of animal origin, indicating a zoonotic potential of this pathogen. The current work contributes to two aspects of current A. baumannii research: i) the occurrence of A. baumannii in animal clinical specimens, especially concerning the occurrence of antimicrobial resistance and ii) the identification of factors, e.g. specific antimicrobial compounds, which contribute to the enrichment of the resistome and clinical success of A. baumannii. A total of 642 clinical human and animal Acb-complex isolates were collected for a one-year time-period starting in February 2013. Identification to species level was performed using restriction fragment length polymorphism (RFLP) of the 16S-23S IGS, as introduced in the present study and was verified by means of partial rpoB and 16S-23S IGS sequencing. A. baumannii was the predominant species among animal Acb-complex isolates, accounting for a proportion of 44.41% and originating from various host species, with a considerably high proportion of 50.92% of isolates being multi-drug resistant (compared to 15.52% of human A. baumannii isolates). This clearly points towards a role of animals in the reinforcement and dissemination of antimicrobial resistances in A. baumannii. Subsequently, 27 clinical human and animal A. baumannii isolates were chosen for whole genome sequencing in order to gain insight in their genomic diversity and relatedness. Additionally, ten published complete genome sequences of human A. baumannii isolates were included in the analysis. Based on SNP analysis of the maximum common genome, a maximum likelihood tree and a distance matrix were generated, revealing a clear separation into a closely related cluster of human multi-drug resistant ST2 isolates and a heterogeneous group of human and animal antimicrobial susceptible non-ST2 isolates. In accordance with previous studies we therefore hypothesize that an ancestral ST2 isolate split from the heterogeneous group in the recent past followed by subsequent adaption to the hospital environment. Moreover, we hypothesized that DNA damaging antimicrobials like fluoroquinolones may play a crucial role in adaption of A. baumannii to antimicrobial selective pressure and new ecological niches. Thus, spontaneous enrofloxacin (ENR) resistant mutant isolates were generated using sublethal ENR concentrations. Comparative genomic analysis of the whole genome sequences of the mutant and their respective wild-type isolates revealed novel mutations in the DNA gyrase encoding genes causing ENR resistance. Furthermore, an association of ENR selective pressure and mutations in the AdeFGH and AdeIJK efflux pump regulator genes adeL and adeN could be demonstrated. Although the present work provides evidence that fluoroquinolone selective pressure can cause a multi-drug resistant phenotype in A. baumannii, no direct association of the resistance phenotype and genomic mutations could be proven. Future research should investigate the role of altered regulatory processes under antimicrobial stress conditions, e.g. due to ROS and sRNAs, in order to understand the mechanisms underlying the rapid evolution and clinical success of specific antimicrobial resistant A. baumannii lineages. Moreover, comprehensive epidemiological studies are urgently needed to assess the potential role of animals as reservoir for antimicrobial resistant A. baumannii and infection source for humans.

Bakterielle Resistenzen gegen antimikrobielle Wirkstoffe sind ein sehr altes Phänomen, welches sich in nur wenigen Jahrzehnten zu einem schwerwiegenden Gesundheitsrisiko entwickelt hat. Gegenwärtig verursachen multi-resistente Bakterien weltweit ernste Erkrankungen bei Menschen wie auch bei Tieren, zu deren Behandlung nur wenige therapeutische Möglichkeiten offenstehen. Zu diesen Bakterien gehört Acinetobacter (A.) baumannii, vor allem in Hinblick auf seine epidemischen klonalen Linien IC I-III, welche in besonderem Maße mit Carbapenem- und Multi-resistenz assoziiert sind. Darüber hinaus wurden diese klonalen Linien bereits bei A. baumannii Isolaten tierischer Herkunft nachgewiesen, was auf ein zoonotisches Potential dieses Krankheitserregers hinweist. Die vorliegende Arbeit beinhaltet zwei Aspekte gegenwärtiger A. baumannii Forschung: i) das Vorkommen von A. baumannii in tierischen klinischen Proben, besonders in Hinblick auf das Auftreten von Antibiotikaresistenzen und ii) die Untersuchung von Faktoren, z. B. bestimmte antimikrobielle Wirkstoffe, die zu einer Vergrößerung des Resistoms und des klinischen Erfolgs von A. baumannii beitragen. Insgesamt 642 klinische humane und tierische Acb-Komplex Isolate konnten innerhalb eines Jahres beginnend im Februar 2013 isoliert werden. Die Speziesbestimmung wurde anhand des Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) der 16S-23S IGS Region durchgeführt und durch partielle rpoB und 16S-23S IGS Sequenzierung verifiziert. A. baumannii war mit einem Anteil von 44.41% die vorherrschende Spezies bei tierischen Acb-Komplex Isolaten und konnte aus einer Vielzahl von Wirtsspezies gewonnen werden. Dabei war ein bemerkenswert hoher Anteil von 50.92% multi-resistent (verglichen mit 15.52% der humanen A. baumannii Isolate). Dies deutet auf eine Bedeutung von Tieren bei der Verstärkung und Verbreitung antimikrobieller Resistenzen von A. baumannii hin. Anschließend wurden 27 klinische humane und tierische A. baumannii Isolate für eine Gesamtgenom-Sequenzierung ausgewählt, um Einblicke in ihre genomische Diversität und Verwandtschaft zu erlangen. Zusätzlich wurden zehn weitere publizierte humane Gesamtgenom-Sequenzen in die Analyse aufgenommen. Basierend auf der SNP Analyse des Maximum Common Genoms (MCG) wurden ein Maximum- Likelihood Baum sowie eine Abstands-Matrix erstellt, welche eine deutliche Trennung zwischen einem eng verwandten Cluster humaner multiresistenter ST2 Isolate und einer heterogenen Gruppe Antibiotika empfindlicher humaner und tierischer nicht ST2 Isolate aufzeigten. Daher nehmen wir in Übereinstimmung mit vorangegangenen Studien an, dass sich in näherer Vergangenheit ein ursprüngliches ST2 Isolat von der heterogenen Gruppe abgespalten hat, gefolgt von der Adaptation an die Krankenhausumgebung. Ferner haben wir angenommen, dass DNA-schädigende antimikrobielle Stoffe wie Fluorochinolone eine zentrale Rolle bei der Adaptation von A. baumannii an antimikrobiellen Selektionsdruck und neue ökologische Nischen spielen. Deshalb wurden spontane Enrofloxacin (ENR) resistente Mutanten durch subletale ENR Konzentrationen generiert. Die vergleichende genomische Analyse der Mutanten und ihrer jeweiligen Wildtyp- Isolate offenbarte neue Mutationen in den DNA-Gyrase kodierenden Genen. Des Weiteren konnte eine Assoziation zwischen ENR Selektionsdruck und Mutationen in den Regulatorgenen adeL und adeN der Effluxpumpen AdeFGH und AdeIJK demonstriert werden. Obwohl die vorliegende Arbeit einen Nachweis dafür gibt, dass Fluorochinolon Selektionsdruck einen multi-resistenten (MDR) Phänotyp in A. baumannii verursachen kann, konnte kein direkter Zusammenhang zwischen MDR Phänotyp und genomischen Mutationen hergestellt werden. Zukünftige Studien sollten sich mit der Rolle veränderter regulatorischer Prozesse unter antimikrobiellen Stress Situationen befassen, beispielsweise durch reaktive Sauerstoffspezies oder kleine RNA, um die Mechanismen, welche der rapiden Evolution und dem klinischen Erfolg bestimmter resistenter A. baumannii Linien zu Grunde liegen, verstehen zu können. Darüber hinaus sind umfassende epidemiologische Studien zur Beurteilung der möglichen Rolle von Tieren als Reservoir für resistente A. baumannii und Infektionsquelle für den Menschen dringend nötig.