Einfluss der glucosidierten Phospholipidanaloga Glc-PC und Glc-PAF auf die Proliferation, Zell-Matrix-Adhäsion und Migration in HaCaT-Zellen

Abstract

Ausgehend von der Beobachtung, dass synthetische Phospholipide antiproliferativ wirken, stellt sich die Frage, welche Mechanismen dies bewirken. Im Rahmen dieser Arbeit werden die Einflüsse der glycosidierten Phospholipidanaloga Glc-PC und Glc-PAF auf physiologische Zellfunktionen untersucht. Die schon in der Literatur beschriebene Wirkung auf das Proliferationverhalten von HaCaT-Zellen konnte in den durchgeführten Proliferationsassays bestätigt werden. Bedeutsam erscheint, dass Glc-PC und Glc-PAF auf Zellen mit autonomem Wachstum einen stärkeren antiproliferativen Effekt haben. Die antiproliferative Wirkung kann nur in serumfreiem Zellkultursystem erzielt werden. Glc-PAF und Glc-PC werden durch fetales Kälberserum inaktiviert. Bei Glc-PAF liegen die antiproliferativ wirkenden Konzentrationen sehr eng bei denen, die bereits toxisch auf die Zellen wirken. Beide Effekte sind daher nicht eindeutig voneinander zu trennen. Anders sieht es bei Glc-PC aus, bei dem die antiproliferativ wirkende Konzentration weit unter der toxischen liegt. Der zeitlich begrenzte, deutlich konzentrationsabhängige Einfluss auf die Zell-Matrix-Adhäsion hat Anlass zu weitergehenden Untersuchungen gegeben. Dabei fällt besonders die Adhäsionssteigerung auf Fibronektin auf. Sie nimmt um das bis zu 6-fache im Vergleich zur Kontrolle zu. Die daraufhin durchgeführten Experimente zur Integrinexpression auf der Zelloberfläche von HaCaT-Zellen zeigt, dass weder die b1- noch a3– Integrinuntereinheiten unter Einfluss der Phospholipide verstärkt exprimiert werden. Eine geringe Expressionssteigerung unter Einfluß von Glc-PC kann für die b4-Untereinheit nachgewiesen werden. Die verstärkte Adhäsion auf den drei Matrices kann damit aber nicht ausreichend erklärt werden. Im Weiteren wird untersucht, ob es durch die synthetischen Phospholipide zu einer Inside-out vermittelten Aktivierung der Integrine kommt. Dafür kommen zum Beispiel die Phospholipase C und die PI3-Kinase in Betracht, deren Signalwege letztlich auch zu einer erhöhten Bindungsaktivität der Integrine führen. Die mit den Inhibitoren für PLC und PI3-Kinase, U73221 und Wortmannin, durchgeführten Adhäsionen ergeben, dass der Aktivitätszustand dieser beiden Enzyme in keinem Zusammenhang mit der durch die Phospholipide bedingten verstärkten Adhäsion steht. Es müssen demnach andere Mechanismen daran beteiligt sein. Deutlich sichtbar wird die Beteiligung des Zytoskeletts an den Veränderungen der Zellfunktionen. Bereits lichtmikrokopisch kann eine Veränderung der Zellform, sowohl durch Glc-PAF als auch durch Glc-PC, beobachtet werden. Von der physiologischen runden Zellform kommt es zu einem zunehmenden spindelförmigen Aussehen und zur Entwicklung von haarfeinen Zellausläufern. Dieser Einfluss ist unabhängig von der Inkubationszeit und der eingesetzten Konzentration der Substanzen. Bereits in der geringsten Konzentration und schon nach 2 h Inkubation ist die Zellform stark verändert. Durch Rhodamin- gekoppeltes Phalloidin kann das Aktin-Zytoskelett der HaCaT- Zellen sichtbar gemacht werden. Es zeigte sich eine Verdichtung der corticalen Fasern. Wie dies jedoch in Zusammenhang mit der verstärkten Adhäsion steht, bedarf weiterer Untersuchungen. Die Zellmotilität der HaCaT-Zelllinie wird durch die glycosidierten Phospholipide in nichttoxischen Konzentrationen nicht beeinflusst. Erst in höheren Konzentrationen von Glc-PC nimmt die Zellmotilität ab. In den durchgeführten Western Blots kann unter Einfluss von Glc-PAF nach 24h Inkubation eine verstärkte Tyrosinphosphorylierung nachgewiesen werden. Um welche Proteine es sich dabei handelt, bedarf weiterer Untersuchungen. Die Ergebnisse der Experimente liefern viele Ansätze für weitere Untersuchungen zur Aufklärung des Wirkmechanismus von glycosidierten Phospholipiden. Zunächst bleibt die Lokalisiation der Phospholipide offen. Dafür gibt es viele Möglichkeiten. Sie können beispielsweise durch Endozytose in das Cytoplasma aufgenommen oder aber in die Plasmamembran integriert werden und dort ihre Wirkung entfalten. Eine Möglichkeit dies aufzuklären wäre beispielsweise eine radioaktive Markierung der Substanzen. Die Überlegung einer Fluoreszenmarkierung wurde verworfen, da dies zu einer zu großen Veränderung des Moleküls führen würde. Weiterhin besteht die Möglichkeit Enzyminhibitoren bzw. -aktivatoren einzusetzen, um den Mechansimus der Adhäsionssteigerung weiter einzugrenzen. Es stehen z.B. Calphostin C als Inhibitor der Proteinkinase C oder Phorbolmyristilacetat (PMA) als Aktivator der Proteinkinase C zu Verfügung. Desweiteren sollten noch andere Integrinuntereinheiten wie z.B. die a5- und av- Untereinheit, die besonders wichtig für die Bindung an Fibronektin sind, auf eine verstärkte Expression hin untersucht werden. Weitere Experimente zur Aufklärung der verstärkten Tyrosinphosphorylierung nach Inkubation mit Glc-PAF müssen noch folgen. Desweiteren müssen auch andere Phosphorylierungsstellen, die bei der integrinvermittelten Zelladhäsion beteiligt sein können, wie Serin und Threonin, untersucht werden.

Synthetic etherlipids possess antiproliferative capacity in various tumor cells. In this study the effects on cell proliferation, cell-matrix adhesion and migration of a novel sub-group of this cytostatic agents, the glycosidatet phospholipids analogues Glc-PC (1-Stearoyl-2-O-α-D-glucopyranosid-sn- glycero-3-phosphocholin) and Glc-PAF (1-O-Octadecyl-2-O-α-D-glucopyranosid-sn- glycero-3-phosphocholin) were characterized in this regard. It could be shown that Glc-PC and Glc-PAF inhibit cell proliferation at non-toxic concentrations in HaCaT cells, a pre-cancerogenic keratinocyte cell line. While the effective concentration of Glc-PAF is very close to its toxic concentration, Glc-PC is less effective than Glc-PAF. The observation that Glc-PAF is more biologically active and more toxic than Glc-PC can depend on the differences in chemical structure. In contrast to the alkyl-phospholipid Glc-PAF is Glc-PC an acyl- phospholipid, which are less metabolic stable. In cells with autonomy proliferation like the squoamous cell carcinoma cell line SCC-25 both phospholipids inhibit proliferation at much lower concentrations. Additionally, both Glc-PC and Glc-PAF have an impact on cell-matrix adhesion on collagen IV, fibronectin and laminin in a concentration and time depended manner. After 2 h incubation with Glc-PC and Glc-PAF attachment of cells increased on all three matrices. After 48 h incubation an effect on the cell- matrix adhesion could not longer be observed. Further investigations demonstrated that the increase of cell-matrix adhesion is not associated with an up-regulation of the expression of the β1, α3 or β3 integrin subunits in HaCaT-cells. It could also be shown that the rise in cell-matrix adhesion was not due to an increased activation of the integrins.