Chemical Synthesis and Biological Evaluation of Cell Surface Carbohydrate Antigens for Rational Vaccine Design

Abstract

Complex carbohydrates are major components of cell surfaces and therefore play an important role in biological systems. In the case of infectious, disease- causing pathogens, cell surface carbohydrate antigens contribute to the recognition of these pathogens by the mammalian immune system, since glycans are part of the outer cell wall which is exposed to the host’s immune cells. The host’s immune response includes the generation of specific anti-glycan antibodies that neutralize the pathogen. Therefore, glycans found on the pathogen’s cell surface can be used as components of preventative vaccines. Any improvement of current vaccines and rational design of new vaccines requires fundamental research of the glycans’ interaction with the immune system, in particular, the identification of the glycan epitope structures that are recognized by the immune system. For these investigations, access to sufficient amounts of pure and well-characterized oligosaccharides is necessary. However, the availability of these molecules is still a limiting factor in the field of glycan research. The first objective of this dissertation is to provide novel glycan antigens found on the cell surface of pathogens using chemical synthesis, since these glycans cannot be obtained from other sources in the same amounts and purity. A systematic approach is taken by the synthesis of larger penta- and tetrasaccharides, as well as comprehensive libraries of smaller mono-, di- and trisaccharide substructures. The second objective involves the biological evaluation of the synthetic antigens with particular focus on the identification of minimal glycan epitopes by microarray technology. In doing so, samples from infected or vaccinated individuals are screened for antibodies against the libraries of synthetic glycan structures. The synthesis and evaluation of the immunogenicity and diagnostic potential of oligosaccharides from Leishmania parasites is described in Chapter 2. Chemical synthesis gave access to several oligosaccharides containing galactose (Gal) and mannose (Man) found on the cell surface of different Leishmania species. Glycan microarray screening of samples from infected dogs identified the two epitopes β-Gal-(1→4)-α-Man and α-Man-(1→2)-α-Man-(1→2)-α-Man that could play a role in canine leishmaniasis infection. In order to raise antibodies that recognize the identified epitopes, a tetrasaccharide containing both epitopes was identified as a hapten for glycoconjugate preparation and subsequent immunization experiments. This work demonstrates the feasibility of an approach that relies on synthetic glycans to identify minimal epitopes, allowing for the rational design and synthesis of glycan antigens used for immunization studies. The same concept was also applied to the PS-I and PS-III glycans present on the surface of Clostridium difficile bacteria, described in Chapter 3. The first total synthesis of the PS-I pentasaccharide repeating unit confirmed the reported chemical structure. An optimized synthesis produced the PS-I pentasaccharide as well as a library of its substructures in sufficient amounts for immunological studies. Phosphodiester-bridged oligomers of the PS-III pseudodisaccharide repeating unit were synthesized by a combination of carbohydrate and phosphoramidite chemistry. For this purpose, an efficient one-pot coupling, oxidation and deprotection procedure for the pseudodisaccharide repeating units was developed. Microarray screening revealed that the sera of hospitalized patients infected with C. difficile contain antibodies against the synthetic PS-I and PS-III glycans, implying their immunogenicity during infection. The binding epitopes of antibodies, obtained by the immunization of mice with PS-I pentasaccharide, were studied with synthetic PS-I substructures. A disaccharide containing rhamnose (Rha) and glucose (Glc) was identified as the minimal epitope of the PSI- pentasaccharide; this was further confirmed by immunization experiments. The PS-I pentasaccharide and the minimal epitope disaccharide, as well as the PS- III oligomers were identified as possible vaccine candidates against C. difficile. Chapter 4 describes the synthesis and evaluation of Streptococcus pneumoniae Serotype 5 (SP5) capsular polysaccharide (CPS) substructures. Synthetic substructures of the CPS repeating unit concentrated on two rare monosaccharides: firstly, the ketone-containing 4-keto-N-acetyl-D-fucosamine (Sug) and secondly, N-acetyl-L-pneumosamine (PneNAc). The synthetic strategy thus devised enabled the preparation of glycans containing Sug or PneNAc. It was found that the ketone is hydrated and unstable; therefore N-acetyl-D-fucosamine (D-FucNAc) was identified as a stable mimic of Sug. Glycan microarray screenings carried out using eleven synthetic glycans and rabbit typing sera containing antibodies specifically produced to only recognize SP5 revealed that a α-PneNAc-(1→2)-GlcA disaccharide is the predominant epitope recognized by these antibodies. Screenings carried out with samples from vaccinated humans further identified a tetrasaccharide as a relevant epitope. Both the disaccharide as well as the tetrasaccharide are ideal targets for vaccine applications, identified by the rational design, synthesis and biological evaluation of cell surface carbohydrate antigens. In conclusion, chemical synthesis and biological evaluation of cell surface carbohydrate antigens demonstrate a rational approach for the identification of glycan epitopes that can be used as components of vaccines against Leishmania, C. difficile and S. pneumoniae.

Komplexe Kohlenhydrate gehören zu den Hauptbestandteilen von Zelloberflächen und sind daher von großer Bedeutung für biologische Systeme. Kohlenhydrate die auf der Zelloberfläche von Krankheitserregern vorkommen, spielen eine besondere Rolle für die Erkennung der Krankheitserreger durch das Immunsystem von Säugetieren. Die Immunantwort des Wirts besteht dabei in der Bildung von neutralisierenden Antikörpern, die spezifisch die Glykane binden. Daher können Glykane, die auf der Oberfläche von Krankheitserregern vorkommen, als Bestandteile von Impfstoffen verwendet werden. Grundlagenforschung zur Wechselwirkung von Glykanen mit dem Immunsystem ist eine Voraussetzung für die Verbesserung existierender und die rationale Entwicklung neuer Impfstoffe. Die Bestimmung von Glykan Epitopen, die vom Immunsystem erkannt werden, ist dabei von besonderer Bedeutung. Ausreichende Mengen von reinen, gut charakterisierten Oligosacchariden sind für diese Untersuchungen notwendig. Die Verfügbarkeit dieser Moleküle ist jedoch ein limitierender Faktor der Glykanforschung. Die erste Zielsetzung dieser Dissertation besteht in der chemischen Synthese von Glykan Antigenen, die nicht aus anderen Quellen in derselben Menge und Reinheit gewonnen werden können. Dabei wird ein systematischer Ansatz gewählt, der den Zugang, sowohl zu größeren Penta- und Tetrasacchariden, sowie umfassende Bibliotheken deren Mono-, Di- und Trisaccharid Substrukturen durch chemische Synthese gewährt. Die zweite Zielsetzung besteht aus der biologischen Evaluation der synthetischen Antigene, dabei liegt ein Fokus auf der Identifikation von minimalen Glykan Epitopen mittels Microarray Technologie. Hierfür werden Proben infizierter oder geimpfter Individuen auf Antikörper gegen die synthetischen Glykane untersucht. Die Synthese sowie die immunologische und diagnostische Evaluation von Oligosacchariden von Leishmania Parasiten wird in Kapitel 2 beschrieben. Oligosaccharide die auf der Zelloberfläche von Leishmanien vorkommen und aus Galaktose (Gal) und Mannose (Man) Bausteinen bestehen, wurden chemisch synthetisiert. Microarray Untersuchungen mit proben von infizierter Hunden ermöglichten die Identifikation zweier Bindungsepitope, nämlich Gal-(1→4)-Man und α-Man-(1→2)-α-Man-(1→2)-α-Man. Ein Tetrasaccharid, das beide Epitope enthält, wurde daraufhin verwendet um in Immunisierungsexperimenten Antikörper zu erzeugen, die diese Epitope binden. Damit wurde das Konzept, das auf synthetischen Oligosacchariden beruht um minimale Epitope und somit die rationale Entwicklung neuer Antigene für Immunisierungsstudien ermöglicht, unter Beweis gestellt. Das selbe Konzept wurde auch auf die Glykane PS-I und PS-III angewandt, die auf dem Bakterium Clostridium difficile vorkommen und in Kapitel 3 beschrieben sind. Die erste Totalsynthese der PS-I Pentasaccharid Wiederholungseinheit ermöglichte zunächst die Bestätigung der publizierten chemischen Struktur von PS-I. Eine optimierte Synthese lieferte das PS-I Pentasaccharid und eine umfassende Bibliothek kleinerer Oligosaccharid Substrukturen für immunologische Studien. Phosphodiester verbundene Oligomere der PS-III Pseudodisaccharid Wiederholungseinheit wurden durch eine Kombination von Kohlenhydratchemie und Phosphoramiditchemie synthetisiert. Zu diesem Zweck wurde eine effizient Eintopfstrategie zur Kopplung, Oxidation und Entschützung der Pseudodisaccharid Wiederholungseinheiten einwickelt. Microarray Untersuchungen ergaben, dass Blutproben C. difficile infizierter Patienten Antikörper gegen die synthetischen PS-I und PS-III Glykane enthalten, somit konnte davon ausgegangen werden, dass PS-I und PS-III immunogen sind. Die Bindungsepitope von Antikörpern, die durch Immunisierung von Mäusen mit dem PS-I Pentasaccharid erzeugt wurden, wurden mittels der synthetischen PS-I Substrukturen untersucht. Ein Disaccharid, bestehend aus Rhamnose (Rha) und Glukose (Glc) wurde als minimales Epitop von PS-I identifiziert und durch Immunisierungsexperimente bestätigt. Das PS-I Pentasaccharid sowie das identifizierte Disaccharide und die synthetisierten PS-III Oligomere kommen somit als Impfstoffkandidaten gegen C. difficile in Betracht. Kapitel 4 beschreibt die Synthese und Evaluation von Substrukturen des Kapsulären Polysaccharids (CPS) von Streptococcus pneumoniae Serotyp 5 (SP5). Dabei lag das Augenmerk auf der Synthese von Oligosacchariden, die die seltenen Zuckern 4-keto-N-Acetyl-D-Fucosamin (Sug) oder N-Acetyl-L-Pneumosamin (PneNAc) beinhalteten. Es wurde festgestellt, dass das Keton des Sug Zuckers hydratisiert und zudem chemisch labil ist. Daher wurde N-Acetyl-D-Fucosamin (D-FucNAc) als stabiles Imitat des Sug Zuckers identifiziert. Microarray Untersuchungen offenbarten, dass ein α-PneNAc-(1→2)-GlcA Disaccharid das minimale Epitop darstellt, dass von Antikörpern erkannt wird, die in Hasen hergestellt wurden um nur SP5 spezifisch zu binden. Weiterführende Untersuchungen, mit Blutproben geimpfter Menschen, identifizierten ein Tetrasaccharid als relevantes Epitop. Somit wurden mit dem Disaccharid und dem Tetrasaccharid zwei Zielstrukturen für Impfstoffanwendungen identifiziert. Die chemische Synthese und biologische Evaluation von Kohlenhydrat Antigenen zeigen einen rationalen Ansatz für die Identifikation von Epitopen die als Impfstoffkomponenten gegen Leishmania, C. difficile und S. pneumoniae verwendet werden können.