Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons

Abstract

Olfactory receptor neurons (ORNs) provide an animal with information about odors in its environment. In mammals and insects, individual ORNs mostly express a single olfactory receptor (OR). ORNs expressing the same OR gene form subpopulations, converging on one or a few spatially invariant glomeruli. Glomeruli are spherical subunits of the olfactory bulb (vertebrates) or antennal lobe (AL, insects), the first olfactory processing center in the brain. Within a glomerulus ORNs make synaptic contacts with inhibitory GABAergic neurons local to the OB/AL and 2nd order neurons relaying the olfactory information to higher brain centers. The basis for understanding how odors are coded within olfactory systems is knowledge about its input. In order to describe the input to olfactory systems we need to know the odors activating or inactivating all subpopulations of ORNs, defined as their molecular receptive ranges (MRR). To this end I characterized the MRR of an exemplary ORN subpopulation in great detail using the model organism Drosophila melanogaster. Employing the UAS-Gal4 system, I expressed Cameleon2.1, a Ca2+ sensitive fluorescent dye, under control of the OR gene promotor Or22a. This allowed me to monitor selectively the odor-evoked responses of the ORNs expressing this OR in vivo by using optical imaging. I tested a panel of 104 odors from a variety of chemical classes. Odor evoked responses were measured from the primary dendrites and somata of the ORNs on the antenna and from their axonal terminals in the glomeruli of the AL. The results showed graded responses to 39 stimuli for which I subsequently established dose-response curves. The most potent odors were ethyl and methyl hexanoate. These odor molecules elicited responses at dilutions as low as 1:100,000,000, thereby showing that Or22a has a broad yet selective MRR challenging the distinction between specialist and generalist ORNs. By systematically testing another 15 structurally very similar odors I was able to determine some molecular determinants of the MRR. These observations were corroborated by a modeling approach in collaboration with Daniel Baum from the Zuse Institute Berlin (ZIB) who developed an algorithm for semi-flexible superpositioning of 3D molecular structures. Comparing the MRR measured in the dendrites and somata on the antenna with the MRR obtained at the axonal endings within the AL, showed that both were identical. This finding further substantiated the notion that the MRR of a glomerulus reflects the odor specificity of the OR expressed in the ORNs innervating it. However, a detailed analysis of antennal and AL response kinetics revealed differences e.g. in fall time and response duration. In order to test whether these temporal differences were due to a shaping role of inhibitory AL local neurons, I applied the ionotropic GABA agonist muscimol and the Cl- channel blocker picrotoxin. I found evidence for odor-specific presynaptic inhibition of ORN responses. While presynaptic inhibition changed the amplitude of the responses, fall time and response duration remained stable. Thus the differences in kinetics of antennal and AL responses could be attributed to different Ca2+ sources contributing to either signal. Finally, I started the characterization of another OR, namely Or47b. This OR is in many regards different from Or22a and of special interest because to date hardly anything is known about the physiology of ORNs expressing Or47b. I identified several ligands the majority of which was inactivating. These results show the coding complexity of the olfactory system already at the input level. This study represents a further step towards understanding odor coding in the periphery of the Drosophila olfactory system. Furthermore, it provides a sound basis for further exploring the role of the AL network.

Olfaktorische Rezeptorneurone (ORN) vermitteln einem Lebewesen Informationen über die Düfte in dessen Umgebung. In Säugetieren und Insekten exprimieren einzelne ORN meist einen einzigen olfaktorischen Rezeptor (OR). ORNs, welche das gleiche OR Gen exprimieren, bilden Subpopulationen, die auf einen Glomerulus bzw. wenige räumlich konstante Glomeruli konvergieren. Glomeruli sind sphärische Untereinheiten des olfaktorischen Bulbus (Vertebraten) oder des Antennallobus (AL, Insekten), die jeweils die erste olfaktorische Verschaltstelle im Gehirn bilden. Innerhalb eines Glomerulus bilden ORN synaptische Kontakte mit inhibitorischen GABAergen lokalen Neuronen und mit Projektionsneuonen, welche die olfaktorische Information an höhere Gehirnzentren weiterleiten. Grundlage für das Verständnis der olfaktorischen Kodierung ist die Kenntnis der Eingangsinformation in das olfaktorische System. Um den Eingang in das olfaktorische System beschreiben zu können, müssen wir die Düfte kennen, welche alle ORN Subpopulationen aktivieren oder inaktivieren. Diese Düfte werden als der molecular receptive range (MRR) der ORN Subpopulationen bezeichnet. Aus diesem Grund habe ich den MRR einer exemplarischen ORN Subpopulation sehr detailliert im Modellorganismus Drosophila melanogaster beschrieben. Mit Hilfe des UAS-Gal4-Systems habe ich Cameleon2.1, einen calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff, unter Kontrolle des OR Genpromotors Or22a exprimiert. Dadurch war ich in der Lage, selektiv die duftevozierten Antworten der ORN, die diesen OR expremieren, in vivo mit Hilfe der optical imaging Methode zu messen. Ich habe ein Set von 104 Düften aus verschiedenen chemischen Klassen getestet. Duftevozierte Antworten wurden an den Dendriten und Somata der ORN auf der Antenne, und an den axonalen Endigungen im Glomerulus des Antennallobus gemessen. Die Ergebnisse zeigten abgestufte Antworten auf 39 Stimuli, von denen ich im Weiteren die Dosis- Antwort-Kurven bestimmte. Die wirksamsten Düfte waren Ethyl- und Methyl- Hexanoat. Diese Duftmoleküle lösten Antworten bei einer Verdünnung von eins zu 100 Millionen aus, was zeigte, dass Or22a zwar ein breites aber dennoch selektives Antwortspektrum hat. Aufgrund dieses Ergebnisses könnte man die Unterscheidung von ORN in Generalisten und Spezialisten in Fragen stellen. Im Folgenden testete ich systematisch 15 weitere strukturell sehr ähnliche Düfte wodurch ich in der Lage war, einige molekulare Determinanten des MRR zu bestimmen. Meine Beobachtungen wurden durch eine Modellierung bestätigt, welche ich in Zusammenarbeit mit Daniel Baum vom Konrad-Zuse-Instiut durchführte. Daniel Baum hat einen Algorithmus entwickelt, welcher die semiflexible Überlagerung dreidimensionaler Molekülstrukturen ermöglicht. Der Vergleich des in den Dendriten und Somata der Antenne bestimmten MRR mit dem in den axonalen Endigungen im Antennallobus gemessen MRR zeigte, dass beide identisch waren. Dieses Ergebnis bekräftigt die Auffassung, dass der MRR eines Glomerulus die Duftspezifität des OR widerspiegelt, welcher in den diesen Glomerulus innervierenden ORN exprimiert wird. Eine genauere Analyse der Antwortkinetiken in Antenne und AL zeigte jedoch Unterschiede zwischen beiden, z.B. in der Abfallzeit der Antworten und in der Antwortdauer. Um zu überprüfen, ob diese zeitlichen Unterschiede auf eine Beeinflussung durch inhibitorische AL Interneurone zurückzuführen waren, applizierte ich den ionotropischen GABA Agonisten Muscimol und den Chloridkanalblocker Picrotoxin. Ich fand Hinweise auf präsynaptische Inhibition der ORN Antworten. Während die präsynaptische Inhibition die Amplitude der Antworten duftspezifisch veränderte, blieben die Abfallzeiten der Antworten und die Antwortdauer unverändert. Von daher können die Unterschiede in den Kinetiken der antennalen und der AL Antworten eher auf die verschiedenen Calciumquellen, welche zum jeweiligen Signal beitrugen, zurückgeführt werden. Schließlich habe ich mit der Charakterisierung der Or47b exprimierenden ORN begonnen. Dieser OR ist in vielerlei Hinsicht unterschiedlich zu Or22a und von besonderem Interesse, da bis heute nur sehr wenig über die Physiologie der ORN, die Or47b exprimieren, bekannt ist. Ich identifizierte mehrer Liganden, von denen die meisten inaktivierend waren. Diese Ergebnisse zeigen die Komplexität der Kodierung innerhalb des olfaktorischen Systems bereits auf Ebene der ORN. Die vorliegende Studie ist ein weiterer Schritt zu unserem Verständnis der Duftkodierung in der Peripherie des olfaktorischen Systems von Drosophila. Darüber hinaus bildet sie eine solide Grundlage für die weitere Erforschung der funktionellen Bedeutung des Antennallobusnetzwerks.