HIV cell-to-cell spread results in earlier onset of viral gene expression by multiple infections per cell

Abstract

Knowledge about the HIV cycle in targeted human cells derives from studies of cell-free infection, whereby distant transmission occurs after viral budding and environmental dispersion. Recently, it has been proven that some viruses, including retroviruses, can be concentrated into multiply infected targets by cell-to-cell spread through virological synapses. Therefore, we investigated whether, how much and how the virus cycle can be modified by the transmission mode. Methodology We followed the onset of HIV-1 gene expression in a fluorescent reporter T-lymphocyte cell line by time-lapse microscopy together with quantitative image analysis. Cell-free was compared to coculture infection, whereby transmission can occur by cell-to-cell and cell-free spread modes. In both conditions, transmission was synchronized to a two-hour window. Target cells were separated from donors by fluorescent markers. The influence of the presence of infected donors was analysed by transwell experiment as well as co-incubation with donors unable to transmit their viruses. The effect of the multiplicity of infection (MOI) was observed in cell-free infection. Viral cooperativity was studied by co-infection with fluorescently labelled viruses. Experiments were also performed under similar conditions in primary human PBMCs and CD4+ T cells using flow cytometry. Results were summarized by mathematical modeling and the average number of viruses per target cell was confirmed by assessing the infection robustness in the face of raltegravir. Result The mean time to detectable onset of viral gene expression in coculture was accelerated by 19% in the reporter cell line and by 35% in PBMCs relative to cell-free infection. Neither factors secreted by infected cells, nor contact with infected cells in the absence of transmission, detectably changed the dynamics. High MOI cell-free infection recapitulated the accelerated viral gene expression observed in cell-to-cell infection. Co-infection with differently labelled viruses did not reveal viral cooperativity or inhibition. Cell-free infection time courses were fitted by Gamma distributions using the different measured MOI values as parameters. The acceleration of viral gene expression with coculture was predicted by an effective MOI of 4.6 per cell, consistent with the number estimated by fitting the drug sensitivity data. Conclusion The more rapid onset of viral gene expression by cell-to-cell spread was consistent with a stochastic model where the fastest expressing virus out of the infecting virus pool sets the time for infection independently of the other co-infecting viruses. This reduction of the eclipse phase could facilitate the establishment of HIV reservoirs.

Die Kentnisse über den HIV-Zyklus in menschlichen Zielzellen leitet sich aus zellfreien Infektionen ab, bei welchen nach viraler Knospung und anschließender Dispersion in das umliegenden Milieu die Übertragung erfolgt. Kürzlich wurde bewiesen, dass einige Viren, einschließlich Retroviren, durch eine virologische Synapse, beziehungsweise durch Zell-zu-Zell-Übertragung, in mehrfach infizierten Zellen konzentriert werden können. Daher untersuchten wir, ob, wie viel und wie der Viruszyklus von den Verbreitungsmodi modifiziert werden kann. Methode Wir folgten dem Beginn der HIV-1-Genexpression in einer fluoreszierenden Reporter-T- Lymphozyten-Zelllinie mit Hilfe von Zeitraffer- Mikroskopie und quantitativer Bildanalyse. Zellfreie Infektion wurde mit Kokultur verglichen, wobei Zell-zu-Zell sowie zellfreie Übertragungen erfolgen. In beiden Fällen wurde die Übertragung auf eine zweistündige Zeitspanne synchronisiert. Die Zielzellen wurden durch Fluoreszenzmarker von den Spenderzellen unterschieden. Der Einfluss des Vorhandenseins von infizierten Spendern wurde durch Transwell-Experimente sowie Koinkubation mit Spendern analysiert, welche ihre Viren nicht übertragen können. Die Wirkung der Multiplizität der Infektion (MOI) wurde in zellfreier Infektion beobachtet. Die Viruskooperativität wurde durch Koinfektion mit verschiedenen fluoreszent markierten Viren untersucht. Experimente wurden auch unter ähnlichen Bedingungen in primären humanen PBMCs und CD4+ T-Zellen anhand von Durchflusszytometrie ausgeführt. Die Ergebnisse wurden durch mathematische Modellierung zusammengefasst und die durchschnittliche Anzahl von Viren pro Zielzelle durch die Abschätzung der Robustheit der Infektion während der Behandlung mit Raltegravir bestätigt. Ergebnisse Die mittlere Zeit bis zum nachweisbaren Anfang der viralen Genexpression in Kokultur wurde im Vergleich zur zellfreien Infektion in der Reporterzelllinie um 19% und in PBMCs um 35% beschleunigt. Weder Faktoren, welche von infizierten Zellen sezerniert wurden, noch Kontakt mit infizierten Zellen ohne Übertragung veränderten die Dynamik. Zellfreie Infektion mit hoher MOI zeigte ebenfalls die beschleunigte Virusgenexpression, welche bei einer Zell- zu-Zell-Übertragung beobachtet wurde. Koinfektion mit unterschiedlich markierten Viren zeigte weder virale Kooperation noch Hemmung. Zellfreie Infektionszeitverläufe wurden durch Gammaverteilungen unter Verwendung der verschiedenen gemessenen MOI-Werte als Parameter beschrieben. Die Beschleunigung der viralen Genexpression mit Kokultur wurde durch eine effektive MOI von 4,6 pro Zelle berechnet, welche mit der durch die Modellierung der Wirkstoffempfindlichkeitsdaten geschätzten Zahl übereinstimmt. Schlussfolgerung Der vorzeitge Beginn der viralen Genexpression durch Zell-zu-Zell-Verbreitung stimmt mit einem stochastischen Modell überein, bei welchem das schnellste Virus aus dem infizierenden Viruspool die Zeit der Infektion unabhängig von den anderen koinfizierenden Viren festlegt. Diese Verringerung der Eklipsephase könnte die Bildung von HIV-Reservoirs erleichtern.