Characterization of microRNA expression in cervical carcinogenesis and cancer stem cells

Abstract

Background: The cancer stem cell (CSC) paradigm is one possible way to understand the genesis of cancer, and cervical cancer in particular. Recently dysfunctional microRNAs have been linked with several diseases, including cancer. Such microRNAs function as master regulators of cell physiology and differentiation. Objective: To explore the relationship between microRNA dysregulation and HPV infection, cervical precancerous lesions and cervical cancer stem cells. Methods: In this study, we first comparatively investigated the oncomir miR-21 and tumor suppressor miR-218 expression by qRT-PCR in 9 cervical cancer cell lines (CaSki, HeLa, SiHa, C33A, MRIH186, MRIH215, C4-1, SW756 and ME180) and 4 foreskin keratinocyte (FK) cell lines (FK08-35, FK09-03, FK09-07, FK09-09) grown adherently as monolayer on cell culture plastic. Then three-dimensional cultures were generated from all cervical cancer cell lines enriching CSCs. Stemness-related microRNAs (miR-34a, miR- 200c, miR-203) and transcription factor expression (Oct3/4, Sox2 and Nanog) were compared to the corresponding monolayer-derived cells. The expression of stem cell markers ALDH1, CD44 and CD24 was also compared between cervical cancer spheroids and their corresponding monolayer cultures. Expression of miRNAs was investigated in Pap smears from patients. Cytological and HPV diagnosis was correlated to the expression of miR-21 and miR-218 in the smear samples. Results: As compared to FKs the cervical cancer cells overexpressed miR-21, and had reduced expression of miR-218. Five cell lines, CaSki, MRIH215, C4-1, ME180 and MARQ, formed spheroids which were highly compact. Four cell lines, HeLa, C33A, MRIH186 and SW756, formed only loose aggregates of cells. SiHa never formed any spheroids. There was generally a down- modulation (1.15-48.64 fold) of miR-34a, miR-200c and miR-203 in spheroids formed by cervical cancer cell lines and up-regulation of stemness transcription factors. There was also a significantly higher proportion of ALDH1+ (2-8 fold), CD44+CD24- (1.5-3.15 fold) and ALDH1+CD44+CD24- (1.14-3.49 fold) populations in cervical cancer spheroids compared with corresponding monolayers. In Pap smears, miR-21 and miR-218 were found to be significantly dysregulated. In the HPV positive group compared to the HPV free group, miR-21 was 8.22 fold up-regulated and miR-218 was 98.44 fold down-regulated. There was no significantly different expression of miR-21 and miR-218 between different cytologically diagnosed groups based on the Bethesda system. Conclusions: Spheroid culture is an efficient method to enrich cervical CSCs. Different expression of miRNAs was found in normal keratinocytes, cervical cancer cell lines and in subcultivated spheroid-derived CSCs potentially reflecting the stemness phenotype of a proportion of cells. The expression of miR-21 and miR-218 was dysregulated by infection of HPV in cervical precancerous lesion.

Hintergrund: Das Paradigma der Krebsstammzellen (CSC) kann die Entstehung von Krebs, und insbesondere Gebärmutterhalskrebs erklären. Dysfunktionale microRNAs wurden kürzlich mit mehreren Krankheiten, darunter Krebs in Verbindung gebracht. Solche microRNAs funktionieren als Hauptschaltstellen der Zellphysiologie und Differenzierung. Ziel: Untersuchung der Bedeutung von microRNA Dysregulation und HPV-Infektion in Präkanzerosen und Gebärmutterhalskrebs-Stammzellen. Methoden: In dieser Studie haben wir zunächst vergleichend die oncomir miR-21 und Tumor-Suppressor miR-218 Expression untersucht. Hierzu wurde durch qRT-PCR bei 9 Gebärmutterhalskrebszelllinien (CaSki, HeLa, SiHa, C33A, MRIH186, MRIH215, C4-1, SW756 und ME180) und 4 Vorhaut-Keratinozyten (FK) Primär-zelllinien (FK08-35, FK09-03, FK09-07, FK09-09), die adhärent als Monolayer auf Zellkulturkunststoffplatten gewachsen waren, die Expression verglichen. Zur Anreicherung von CSC wurden alle Gebärmutterhalskrebszelllinien in dreidimonsionalen Sphäroid-Kulturen kultviert. Die Expression stammzellspezifischer microRNAs (miR-34a, miR-200c, miR-203) und Transkriptionsfaktoren (Oct3/4, Sox2, Nanog) wurde mit den entsprechenden, als Monolayer adhärent kultivierten Zellen, verglichen. Die Expression der Stammzellmarker ALDH1, CD44 und CD24 wurde ebenfalls zwischen Sphäroid- und Monolayerkulturen verglichen. Schliesslich wurde die Expression von miRNAs in Pap-Abstrichen von Patientinnen untersucht. Die zytologische und HPV Diagnose wurde zur Expression von miR-21 und miR-218 in den Abstrichproben korreliert. Ergebnisse: Im Vergleich zu FKs, zeigten die Gebärmutterhalskrebszelllinien Überexpression von miR-21, und verringerte Expression von miR-218. Fünf Zelllinien CaSki, MRIH215, C4-1, ME180 und MARQ bildeten Sphäroide, die sehr kompakt waren. Vier Zelllinien, HeLa, C33A, MRIH186 und SW756-bildeten nur lose Aggregate von Zellen. SiHa bildete nie Sphäroide. Im allgemeinen wurde eine Herabmodulation (1,15-48,64 fach) von miR-34a, miR-200c und miR-203 in Sphäroiden und eine Hochregulierung von Stammzell-spezifischen Transkriptionsfaktoren gemessen. Es wurde ein deutlich höherer Anteil an ALDH1+ (2-8 fach), CD44 + CD24- (1,5 bis 3,15 fach) und ALDH1+ CD44 + CD24- (1,14 bis 3,49 fach) positiven Zellen in Sphäroiden im Vergleich zu Monolayer- kultivierten Zellen gefunden. In Pap-Abstrichen waren miR-21 und miR-218 deutlich dysregulierten. In der HPV-positiven Gruppe im Vergleich zur HPV negativen Gruppe war miR-21 8,22 fach hochreguliert und miR-218 war 98,44 fach herabreguliert. Es wurde keine signifikant unterschiedliche Expression von miR-21 und miR-218 zwischen verschiedenen zytologischen Diagnosegruppen (Einteilung nach Bethesda System) gefunden. Schlussfolgerungen: Sphäroidzellkultur ist eine effiziente Methode, um Gebärmutterhalskrebsstammzellen anzureichern. Unterschiedliche Expression von miRNAs wurde in normalen Keratinozyten, Gebärmutterhalskrebszelllinien sowie in subkultivierten Sphäroid-abgeleiteten CSCs gefunden. Dies refluktiert, potenziell den Anteil des Stammzell phänotyps. Die Expression von miR-21 und miR-218 wird wahrscheinlich durch Infektion mit HPV in zervikalen Präkanzerosen fehlreguliert.