Investigating the role of toll-like receptors in the glioma microenvironment

Abstract

Peripheral macrophages and resident microglia constitute the dominant glioma- infiltrating cells. The tumor induces an immunosuppressive and tumor supportive phenotype in these glioma associated microglia/brain macrophages (GAMs). A subpopulation of glioma cells has stem cell properties such as self- renewal, multipotency and act as glioma stem cells (GSCs). In the present study we explored the interaction between GSCs and GAMs. Using CD133 as a marker of stemness, we either enriched for or deprived the mouse glioma cell line GL261 of GSCs by FACS. Over the same period of time, 100 CD133+ GSCs had the capacity to form a tumor of comparable size to the ones formed by 10000 CD133- GL261 cells. In IL-6-/- mice, only tumors formed by CD133+ cells were smaller when compared to wild-type. After stimulation of primary cultured microglia with conditioned medium from CD133 enriched GL261 glioma cells, we observed an upregulation in microglial IL-6 secretion while medium from CD133 deprived gliomas did not trigger this release. This upregulation was selective for IL-6 as compared to a battery of other cytokines (e. g. TNF-α or IL-4). This upregulation depended on Toll-like receptor (TLR) 4, a pattern recognition receptor which can trigger pro-inflammatory cytokine release, since the effect was abolished in the TLR4-/- mouse, but not in other strains deficient for other TLRs. Our results show that GSCs, but not the bulk glioma cells, initiate microglial IL-6 secretion via TLR4 signaling and that IL-6 regulates glioma growth by supporting GSCs. Using human glioma tissue we could confirm the finding that GAMs are the major source of IL-6 in the tumor context.

Periphere Makrophagen und residente Mikroglia stellen die dominante Glioblastom infiltrierende Zellpopulation dar. Das Glioblastom induziert einen immunsupprimierten und Tumor fördernden Phänotyp in den Glioblastom assoziierten Mikroglia und Makrophagen. Eine Subpopulation der Glioblastom- Zellen hat Stammzelleigenschaften wie: Selbsterneuerung, Multipotenz und agieren als Glioblastom-Stammzellen. In der aktuellen Studie untersuchten wir die Interaktion zwischen Glioblastom-Stammzellen und Glioblastom assozierten Mikroglia und Makrophagen. Unter Nutzung des Tumorstammzellmarkers CD133 haben wir die Maus Glioblastom-Zelllinie GL261 angereichert bzw. befreit von Glioblastom-Stammzellen mittels Durchflusszytometrie. 100 CD133+ Glioblastom- Stammzellen besaßen die Fähigkeit über die selbe Zeitspanne Tumoren von vergleichbarer Größe zu initiieren wie 10000 CD133- GL261-Zellen. In der IL-6-/- Maus waren nur Tumore aus CD133+ Zellen kleiner im Vergleich zur Wildtyp Maus. Nach Stimulation von primär kultivierten Mikroglia mit konditioniertem Medium von CD133 angereicherten GL261-Zellen konstatierten wir eine Hochregulierung der mikroglialen IL-6 Sekretion, wobei im Vergleich konditioniertes Medium von CD133 befreiten GL261-Zellen die Hochregulierung nicht auslöste. Diese Zytokinsekretions-Hochregulierung galt selektiv für IL-6 im Vergleich zu einem Panel an anderen Zytokinen (wie zum Beispiel TNF-α oder IL-4). Des Weiteren konnten wir feststellen, dass diese Hochregulation von Toll-like Rezeptor 4 abhängig war. Toll-like Rezeptor 4 ist ein zu der Gruppe der Pattern Recognition Rezeptoren zählende Struktur, welche die Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen auslösen kann. Die Schlussfolgerung der TLR4-Abhängigkeit konnten wir ziehen, weil der Effekt der IL-6 Sekretions- Hochregulierung in der TLR4-/- ausgelöscht war, nicht aber in Linien mit Knockout für andere Toll-like Rezeptoren. Unsere Ergebnisse zeigen auf, dass Glioblastom-Stammzellen spezifisch eine mikrogliale IL-6 Sekretion mittels TLR4 Signalweg auslösen und IL-6 wiederum Tumorwachstum fördernd wirkt durch Unterstützung der Glioblastom-Stammzellen. Unter Nutzung von humanem Glioblastomgewebe konnten wir unsere Entdeckung verifizieren, dass Glioblastom assoziierte Mikroglia und Makrophagen die Hauptquelle für IL-6 im Tumorkontext sind.