Microarrays zur Erforschung rheumatischer Erkrankungen: vom Einzelmarker zur systembiologischen Betrachtung

Abstract

Die Microarray-Technologie hat die Erforschung molekularer Mechanismen in der Medizin revolutioniert. In der Rheumatologie mit zahlreichen ätiologisch ungeklärten Krankheitsbildern ist die Möglichkeit entstanden, eine Übersicht über alle bekannten molekularen Mechanismen von Entzündungsvorgängen zu erstellen. Mit der Generierung umfangreicher Datensätze sind aber auch die Anforderungen an die bioinformatische Aufarbeitung und an die Planung dieser Experimente gestiegen. Die vorliegende Arbeit zeigt schrittweise die Strategien der Datenerhebung und die Entwicklung neuer Konzepte zur Daten- Auswertung. Am Beispiel der Synovitis wird verdeutlicht, mit welchem Informationsgehalt aus konventionellen Analysen, wie der Histopathologie, die Interpretation der molekularen Daten eines Microarray Experiments zu konkurrieren hat. Die gezielte Untersuchung einer Gengruppe wie der „bone morphogenetic proteins“ verdeutlicht, dass Microarrays verlässliche Expressionsdaten liefern. Der einfache Vergleich zwischen „gesund“ und „krank“ benötigt jedoch umfangreiche Validierungsexperimente. Eine systematische Analyse mit dieser Vorgehensweise ist jedoch nicht zielführend. Vielmehr ist erforderlich, Grundbausteine in Form von charakteristischen Expressionssignaturen zu erstellen und diese in ein komplexes Auswertungssystem einfließen zu lassen. Es wurden deshalb an definierten Zellen Vergleiche zwischen „krank“ und „gesund“ durchgeführt, der Einfluss von Medikamenten getestet, Wechselwirkungen zwischen Zellen durch Stimulation von definierten Zellen mit Kulturüberständen untersucht, sowie Referenzsignaturen von Immunzellen im Normalzustand als Vergleichsgrößen für die Abschätzung der Zellzusammensetzung bei der Untersuchung von Blut getestet. Schließlich wurde eine neue bioinformatische Analysestrategie, die funktionelle Profilkomponenten-Analyse (FPCA) entwickelt, die mit Hilfe von Referenzsignaturen eine systematische Aufschlüsselung in funktionelle Bestandteile ermöglicht. Diese Methode wurde mit entzündetem Synovialgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis überprüft, um Änderungen der zellulären Zusammensetzung eines Gewebes, also die Infiltration von Immunzellen, qualitativ und quantitativ zu beurteilen. Zusätzlich konnten in einem zweiten Schritt diese Änderung der Zellzusammensetzung berechnet werden. Durch den Vergleich des tatsächlich gemessenen Profils mit einem für jede Probe individuell berechneten virtuellen Mischprofil auf der Basis von Normalzuständen für jeden Zelltyp kann die tatsächlich stattfindende Genregulation und damit die molekulare Pathophysiologie herausgefiltert werden. Das neu entwickelte Konzept der Analyse ist für alle Untersuchungsproben, die Zellmischungen beinhalten, hilfreich. Insbesondere gilt dies für Gewebe, die entzündlichen Veränderungen unterliegen, da in diesen Vergleichen zu Normalgewebe eine Vielzahl zelltypspezifischer Transkripte erkannt werden, die nicht unmittelbar an den Pathomechanismen beteiligt sind. Dies trifft nicht nur für Entzündungserkrankungen, sondern beispielsweise auch für Tumorgewebe zu, bei dem häufig Begleitentzündungen angetroffen werden. Das Konzept der Bestimmung von Signaturanteilen über Markergene ist ferner erweiterbar für die Quantifizierung von Zytokinsignaturen und damit pathophysiologisch relevante Profilkomponenten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der schrittweise Aufbau von Referenzsignaturen ein elementarer Baustein für die funktionelle Interpretation von Microarray-Daten darstellt. Eine bioinformatische Analyse, die diese Referenzsignaturen berücksichtigt, kann nicht nur dazu beitragen, Biomarker effizienter zu erkennen, sondern kann auch funktionelle Komponenten in einem Expressionsprofil quantifizieren und damit eine ganzheitliche systembiologische Betrachtung ermöglichen.

Microarray technology has revolutionized research on molecular mechanisms in medicine. In rheumatology with its many etiologically unclear diseases the possibility arises to generate an overview of all known mechanisms of inflammatory processes. In addition, extensive sets of data have also increased the requirements for adequate bioinformatic processing and experimental design. This work demonstrates stepwise the strategies for generating a framework of data sets as well as new concepts of data analysis. Using synovitis, conventional analysis like histopathology illustrates the expectations against which interpretation of molecular data from microarray experiments has to compete. Focussing on a defined group of genes, the bone morphogenetic proteins, demonstrates that microarrays provide reliable data. However, plain comparison between the diseased and healthy status requires extensive validation experiments. Such an approach for systematic analysis is not accomplishable. It is more important to generate basic modules of characteristic expression signatures and to integrate these in complex algorithms of analysis. Thus, investigation concentrated on differences between disease and control in defined cell types, on effects of drugs, on cross-talk between cells by stimulation of defined cells with culture supernatant and on cellular composition of blood using reference signatures of normal purified immune cells. Finally, a new strategy for analysis was developed, the functional profile component analysis (FPCA) that enables a systematic breakdown into functional components using reference signatures. This algorithm was tested using synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis to evaluate in a qualitative and quantitative manner the cellular composition and thus the infiltration of immune cells. In a second step, changes of cellular composition were calculated and used to generate a sample specific virtual expression profile based on the mixture of normal cells. The real synovial expression profile was compared to this virtual profile to identify effectively regulated genes and thus to extract the molecular pathophysiology. This new concept is applicable to all samples that are composed of different cell types. It is of particular importance for inflamed tissue, as plain comparison with healthy control tissue reveals a multitude of cell type specific transcripts which are not directly involved in the pathomechanisms. Furthermore, it may be important also for tumor tissue which may frequently present with concomitant inflammation. The concept of calculating signature components based on marker genes can be extended to quantify cytokine signatures and thus pathophysiologically relevant profile components. In summary, it was demonstrated that stepwise generation of reference signatures is a basic module for functional interpretation of microarray data. Bioinformatic analysis that accounts for reference signatures does not only improve identification of biomarkers but may also quantify functional components and thus enable an integral view on the biological system.