Die Rolle intestinaler microRNAs und ihrer Zielgene in der postnatalen Darmentwicklung von Ferkeln insbesondere während der Absetzphase und nach Pathogen- sowie Probiotika-Pathogen-Exposition

Abstract

Infektionen von Ferkeln während der Absetzphase können besonders kritisch sein und mit erhöhter Mortalität einhergehen. Der protektive Effekt der Milch fällt weg und die Ferkel werden zusätzlich großen Mengen neuer Nahrungs- und mikrobieller Antigene ausgesetzt. Während dieses Zeitraumes finden essentielle morphologische und funktionelle Veränderungen der Darmmukosa statt, die über eine Regulierung der Genexpression gesteuert werden. MiRNAs werden hierbei als bedeutende Regulatoren der Genexpression auf post-transkriptioneller Ebene angesehen. Ihre Beteiligung bei Zelldifferenzierungsvorgängen, der Organentwicklung und bei Pathogen-Wirt Interaktionen wurde bereits beschrieben. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, eine entwicklungsspezifische Expressionsanalyse von mRNA sowie miRNA durchzuführen, die zum besseren Verständnis der postnatalen Darmentwicklung bei Ferkeln, insbesondere während der Absetzphase beiträgt. Hierzu wurden Darmproben (Ileum und Colon ascendens) an sechs Zeitpunkten (7- 56 d post natum) gewonnen. Die Genexpressionsanalyse der mRNA sowie miRNA erfolgte auf transkriptioneller Ebene mittels Microarrayanalysen, gefolgt von einer integrativen Analyse beider Datensätze. Erstmalig konnte innerhalb dieser Arbeit das miRNA Expressionsmuster im porcinen Ileum und Colon ascendens aufgezeigt werden. MiRNAs, die zum Zeitpunkt des Absetzens differentiell reguliert gewesen waren, zeigten vor allem eine Beteiligung bei Signalkaskaden, die Einfluss bei Wirt- Pathogen-Interaktionen sowie Zellproliferationsvorgängen haben. Des Weiteren wurden erstmalig Regulatoren vorhergesagt, die während der postnatalen Darmentwicklung insbesondere bei der Ausbildung von Entzündungsgeschehen wie beispielsweise chronisch entzündlichen Darmerkrankungen oder Darmkrebs eine entscheidende Rolle spielen könnten. Auf Grundlage dieser Erkenntnisse könnten Ansatzpunkte zur Behandlung von Erkankungen, die in dieser kritischen Entwicklungsphase des Darmes auftreten, gefunden werden. Schweine, die sich zum Zeitpunkt der Geburt und während der postnatalen Darmentwicklung mit Salmonellen infizieren, bleiben häufig auch in späteren Entwicklungsphasen infiziert. Da sich Schweine in der Regel latent infizieren, stellen sie eine Hauptursache für lebensmittelbedingte Infektionen beim Menschen dar. Bestrebungen, die Infektion bei Schweinen schon zu frühen Entwicklungsphasen zu bekämpfen, sind daher wünschenswert. Aus diesem Grund bestand ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit, in der Charakterisierung des regulatotorischen Einflusses von miRNAs während einer experimentellen S. Typhimurium Infektion sowie bei gleichzeitiger Applikation des Probiotikums E. faecium während der postnatalen Darmentwicklung. Die Charakterisierung erfolgte zu den Zeitpunkten 3 h-28 d post infectionem (28–56 d p.n.). Erstmalig wurde das miRNA Expressionsprofil im porcinen Ileum und Colon ascendens während einer experimentellen Salmonelleninfektion sowie nach Applikation des Probiotikums E. faecium beschrieben. Hierbei zeigte sich, zum ersten Mal, die darmabschnittsspezifische zeitlich unterschiedliche Beeinflussung von Salmonella-spezifischen Signalkaskaden durch miRNAs. Beide Darmabschnitte wurden aus diesem Grund getrennt voneinander betrachtet. Im Colon ascendens wurden v.a. miRNAs identifiziert, die während einer Salmonelleninfektion differentiell reguliert waren und Einfluss auf die adaptive Immunantwort nahmen. Eine RTqPCR Analyse zeigte eine verstärkte miR-34a Expression nach Salmonella Infektion, das potentielle Zielgen der Selektin-P-Ligand (SELPLG) hingegen eine verminderte Expression. Reporterassaystudien bestätigten diese Interaktion im humanen sowie porcinen Zellmodell und dies stellt damit die erstmalige Beschreibung dieser Interaktion dar. Die integrative Analyse der mRNA und miRNA Expressionsprofile im Ileum ergab vor allem einen regulatorischen Einfluss der miRNAs während der Salmonelleninfektion auf fokale Adhäsionen und Aktin-Zytoskelett-Signalkaskaden. Die miR-29a übernahm dabei eine herausragende regulatorische Funktion, beispielsweise wurde Caveolin 2 (CAV2) von ihr reguliert. Mittels RT-qPCR Studien konnte eine Hochregulierung der miR-29a nach Salmonella Infektion nachgewiesen werden, wohingegen das potentielle Zielgen CAV2 eine verminderte Expression zeigte. Reporterassaystudien sowie RNAi und CAV2 Überexpressionsstudien, bestätigten CAV2 als direktes Zielgen der miR-29a. Dies stellt die erstmalige Charakterisierung dieser Interaktion dar. Ein knock-down von CAV2 resultierte in einer Proliferationshemmung von porcinen sowie humanen intestinalen Zellen. Des Weiteren konnte eine erhöhte Salmonelleninvasion in humane intestinale Zellen durch Regulierung des Aktivierungsstatus der RhoGTPase CDC42 nachgewiesen werden. Eine gleichzeitige Applikation des Probiotikums E. faecium resultierte in keiner veränderten Expression von CAV2 und miR-29a im Ileum. Möglicherweise verhindert die Konkurrenz zwischen E. faecium und Salmonella den physischen Kontakt von Salmonellen mit intestinalen Epithelzellen, einhergehend mit verminderter Expression von fokalen adhäsionsähnlichen Strukturen und damit verringerter bakterieller Aufnahme. Die vorliegende Arbeit ermöglicht die Identifikation neuer Therapiemöglichkeiten bezüglich entzündlicher Vorgänge im Darm während der postnatalen Darmentwicklung, durch beispielsweise die Entwicklung von siRNAs, die spezifische Signalwege unterbrechen. Auch liefert sie durch die Beschreibung, wie miRNAs direkt Einfluss nehmen können auf die Invasion von Salmonellen in intestinale Zellen sowie die Beeinflussung der Wirtsimmunantwort neue Ansatzpunkte bei der Salmonellenbekämpfung.

Infections of piglets during the weaning period can be fatal and thus leading to increased mortality. During that period, the protective effect of milk is missing and piglets are exposed to new antigens, as for instance feed antigens. Furthermore, due to the essential change in intestinal mucosal function and morphology during that period, the intestine is extremely stressed. Regulation of gene expression is essential for growth and development of intestinal mucosa. A major class of mammalian gene modulators is constituted by miRNAs. It is known that miRNAs play a major role in cell differentiation processes, organ development and pathogen-host-interactions. The aim of this study was to characterise the regulative influence of miRNAs during the porcine postnatal intestinal development focusing on the weaning phase. For this purpose intestinal tissue samples (Ileum and ascending colon) from healthy piglets were collected within 7–56 d post natum. Gene expression analyses of mRNA and miRNA were conducted by microarray analysis, followed by integrative analysis of both datasets. For the first time it was shown, in this work, the expression of miRNAs in the porcine ileum and ascending colon. Particularly at weaning differentially regulated miRNAs were involved in hostpathogen- interactions and cell proliferation pathways. Furthermore this study represents the first characterisation of major gene expression regulators during the porcine postnatal development, which are mainly involved in intestinal inflammation for example inflammatory bowel disease or cancer. Based on these findings approaches to treating diseases that occur during this critical phase of development of the intestine, could be found. At birth and during the postnatal development with Salmonella infected pigs often remain infected in later development phases. Pigs are usually latently infected with Salmonella; thereby they are a major cause of food-borne infections in humans. Efforts to fight the infection in pigs are therefore desirable already at early stages of development. For this reason a further aim of this study was to characterise the regulative influence of miRNAs during S. Typhimurium infection. This was done in animals with and without additional treatment with the probiotic strain E. faecium. Samples from both groups were taken 3 h–28 d post infection (28-56 d p.n.). For the first time, the miRNA expression profile has been described in porcine ileum and ascending colon during experimental Salmonella infection as well as after administration of the probiotic strain E. faecium. The results showed, for the first time, that the influence of Salmonella-specific pathways is time dependant and differentially regulated in both loci. Therefore both parts of intestine were considered separately. In ascending colon the identified miRNAs mainly regulate the adaptive immunity. RT-qPCR studies showed an increased miR-34a expression directly after Salmonella infection. In contrast the potential target Selectin-P-Ligand (SELPLG) showed a decreased expression. Reporter gene assays in human and porcine cell lines confirmed SELPLG as a miR-34a target and thus represents the first characterization of this interaction. Integrated expression analysis with target prediction in ileum identified miRNAs that mainly regulate focal adhesion as well as actin cytoskeleton pathways. MiR-29a was involved in most calculated interactions including Caveolin 2 (CAV2). RT- qPCR experiments verified upregulation of miR-29a after infection while its predicted target CAV2 was significantly downregulated as shown by RT-qPCR and immuno detection. Reporter gene assays as well as RNAi experiments confirmed CAV2 as miR-29a target in human and porcine intestinal cells. This represents the first characterization of this interaction. Knock-down of CAV2 in human intestinal epithelial cells resulted in retarded proliferation and in increased bacterial uptake by regulating the activation state of the small Rho GTPase CDC42. A simultaneous application of the probiotic strain E. faecium resulted in no change in expression of miR-29a and CAV2 in the ileum. Maybe the competition between E. faecium and Salmonella prevented physical contact of Salmonella with intestinal epithelial cells, accompanied by reduced expression of focal adhesion structures and associated reduced intake. These results show, for the first time, that during Salmonella infection the influence of miRNA differs depending on the intestinal subdivision. The study provides the identification of new therapy strategies with respect to the inflammatory bowel disease during postnatal development by searching for molecules interrupting signaling pathways or the specific delivery of therapeutic siRNA. In addition this study gives new ideas for the control of Salmonella infection by the description of how miRNAs could regulate cellular uptake of Salmonella and by manipulation of host immunity.