Untersuchungen zur Entstehung von Aβ-Peptiden und deren molekulare Wechselwirkungen mit Lipiden der zellulären Plasmamembran

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden drei Teilprojekte verfolgt: (1) Untersuchung des Einflusses von ausgewählten familiären APP-Mutationen (APP- FAD) auf den Spaltmecha- nismus der γ-Sekretase. (2) Analyse der Interaktion von Aβ-Peptiden mit Lipiden der zellulä- ren Plasmamembran im Hinblick auf einen möglichen Toxizitätsmechanismus (3) Charakteri- sierung der Bindung von Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) an Lipidoberflächen mittels Oberflä- chenplasmonresonanz (SPR). (1) In diesem Teilprojekt wurde der Einfluss von ausgewählten APP FAD-Mutationen auf die sequenzielle Prozessierung der γ-Sekretase erstmals mittels chromatographischer und mas- senspektrometrischer Methoden untersucht. Über den direkten Nachweis der entstehenden Tri- und Tetrapeptide wurde im Detail gezeigt, dass alle drei untersuchten APP FAD- Mutationen (T714I, V717F, L723P) gleichermaßen den Wechsel in die Aβ42-Produktlinie bereits an der ε-Schnittposition vollziehen. Der sequenzielle Mechanismus der γ-Sekretase wird durch die konkrete Position der Mutationen nicht beeinflusst. Mittels ELISA wurde nachgewiesen, dass die Mutationen T714I und L723P die Produktion von Aβ42 und Aβ38 besonders erhöhen, sowie Aβ40 verringern. V717F wirkte hingegen auf das Aβ42/40-Verhältnis alleinig über eine verstärkte Aβ42-Produktion. Im in vitro γ-Sekretase-Ansatz zeigten die APP FAD-Mutationen beachtliche Unterschiede in der Gesamtmenge von Aβ und AICD. Die Reduktion von Gesamt-Aβ korrelierte dabei mit dem Rückgang von Gesamt-AICD, wodurch zusätzlich ein Effekt der Mutationen auf die ε- Spalteffizienz aufgezeigt wurde. Ebenso wurde anhand von Zirkulardichroismus-Analysen Veränderungen der Konformation der drei FAD-C100-Substrate im Vergleich zum Wildtyp festgestellt. Aus den Analysen der γ-Sekretase-Prozessierung von APP FAD-Mutationen ergibt sich eine zentrale Bedeutung des ε-Schnitts als entscheidender Faktor für die Initiierung der Produktli- nien. Diese Erkenntnis könnte für die Entwicklung neuer Therapeutika von Bedeutung sein, um spezifisch den ε-Schnitt zu beeinflussen und die Aβ-Produktion vermehrt in die Aβ40- Produktlinie zu verschieben. (2) Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die systhematische Analyse der Aβ-Lipid-Interaktion mittels SPR. Gezeigt wurde, dass das neurotoxische Aβ42wt-Peptid stärker an Sphingomye- lin (SM), GM1, Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), SM:Cholesterin (4:1) und einem physiologischen Lipidgemisch neuronaler Zellmembranen (BTLE) bindet als die nicht toxischen Spezies Aβ40wt und Aβ42 G33I. Damit ergab sich erstmals ein beachtlicher Unterschied zwischen Aβ42wt und Aβ40wt bei der Interaktion mit Lipiden, der vor allem für SM und GM1 nachgewiesen wurde. Mittels chromatographischer Trennung verschiedener Aβ-Oligomerformen und anschließen- der SPR- Bindungsanalysen stellte sich interessanterweise eine besonders hohe Interaktion von Aβ42wt-Tetrameren - den toxisch wirkenden Oligomerformen - auf SM gegenüber PC heraus. Oligomere von Aβ40wt oder Aβ42 G33I zeigten hingegen keine Interaktion. Ferner wurde über Calcein-Freisetzungs-Analysen ermittelt, dass SM-Membrandoppel- schichten gegenüber Aβ42wt besonders labil und lokal leicht zu stören sind. Aus diesen Daten ergeben sich daher neue Hypothesen im Hinblick auf einen potentiellen Pathomechanismus. Membranregionen mit einem hohen Anteil SM, wie z.B. „Lipid rafts“ oder SM-Cluster könnten für die Membraninteraktion mit Aβ42wt-Tetrameren von besonde- rer Bedeutung sein und eine spezifische Funktion bei der Vermittlung der Toxizität in vivo einnehmen. (3) In diesem Teilprojekt wurde erstmals die Bindung zwischen CSF von Alzheimer-Patienten (AD) und einer Kontrollgruppe auf mit PC, SM und BTLE beschichteten Oberflächen mittels SPR untersucht. Auf allen untersuchten Lipidoberflächen konnte eine signifikant höhere Assoziation der CSF- Proben aus AD-Patienten detektiert werden, die besonders ausgeprägt auf der SM- Oberfläche war und eine Unterscheidung zwischen beiden Gruppen ermöglichte. Um die Ursache dieser Differenz näher zu untersuchen, wurden die gebundenen Interakti- onspartner aus der SPR-Analyse aufgereinigt und die Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert. Das Protein Clusterin (CLU) wurde als mit Abstand stärkster Bindungspartner ermittelt und war im AD-CSF signifikant erhöht. Dieses Ergebnis ist bemerkenswert, da CLU in genetischen Assoziationsstudien mehrfach als Risikofaktor beschrieben wurde und derzeit als eines der drei zentralen Risikogene in der AD gilt. Zusammenfassend lassen sich aus der starken Interaktion von CLU gegenüber SM und der im Teilprojekt 2 nachgewiesen hohen Affinität von Aβ42-Tetrameren möglicherweise ent- scheidende funktionelle Zusammenhänge erkennen, die CLU als Risikofaktor in der AD er- klären. Zudem ergibt sich auf Basis der vorliegenden Daten ein völlig neuartiger Ansatz im Vergleich zur aktuellen Diagnostik der Alzheimer- Krankheit.

This work includes three sub-projects: (1) Evaluation of the impact of selected familial APP mutations (APP FAD) on the cleavage mechanism of the γ-secretase. (2) Analysis of the interaction of Aβ-peptides with lipids of the plasma membrane in particular with regard to a possible toxic mechanism (3) Characterization of the binding of human cerebrospinal fluid (CSF) to lipid surfaces using surface plasmon resonance (SPR). (1) In the present study the effect of APP FAD-mutations on the sequential processing of γ- secretase was investigated by chromatographic and mass spectrometric methods. Direct detection of the tri- and tetra-peptides generated during γ-secretase processing in vitro was accomplished. It was shown in detail that all three investigated APP FAD mutations (T714I, V717F, L723P) shift the processing into the Aβ42-line already at the ε-cleavage site. The sequential mechanism of γ-secretase was not influenced by the specific position of the FAD mutations. By ELISA it has been demonstrated that the mutations T714I and L723P increase the production of Aβ42 and Aβ38, and reduce Aβ40. V717F changes the Aβ42/40-ratio solely by an enhanced production of Aβ42. In an in vitro γ -secretase-approach the APP FAD mutations showed significant differences in the total amount of Aβ and AICD. The reduction of total Aβ correlated with the decrease of total AICD, which showed an additional effect on the ε-cleavage efficiency. Based on circular dichroism analysis conformational differences of the three FAD C100 substrates could be detected compared to the wt. The analysis of the γ-secretase processing of APP-FAD mutations suggests a central importance of the ε-cleavage site as a crucial factor for the initiation of the two product lines. This finding may be useful for developing new therapeutic agents that specifically shift the Aβ production to the Aβ40 product line. (2) A focus of this work was the systematic analysis of Aβ-lipid interactions using SPR. It was demonstrated that the neurotoxic peptide Aβ42wt binds more strongly to sphingomyelin (SM), GM1, phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), SM: cholesterol (4:1), and a physiological mixture of neuronal lipid membranes (BTLE) than its non-toxic counterparts Aβ40wt and Aβ42 G33I. The results show for the first time a significant difference between Aβ42wt and Aβ40wt in the interaction with specific lipids in particular with SM and GM1. The chromatographic separation of different oligomeric forms of Aβ and following SPR analysis, presented a particularly high interaction of Aβ42wt tetramers - the proven toxic oligomeric form - on SM compared to PC. Oligomers of Aβ40wt or Aβ42 G33I on the other hand showed no interaction. It was also determined by using calcein release assay that SM- membrane bilayers are particularly labile towards Aβ42wt and get easily disturbed. The data of this study, therefore, yield new hypotheses regarding a potential pathogenic mechanism. Membrane regions with a high percentage of SM, such as "lipid rafts" or SM- clusters could be of particular importance for the membrane interaction with Aβ42wt tetramers and may play a crucial role in mediating their in vivo toxicity. (3) In this project the binding of CSF samples of AD patients (AD) and samples of a control group were investigated on PC, SM and BTLE coated surfaces by SPR. All three examined lipid surfaces have shown a significantly higher association of CSF samples from AD patients, which was particularly pronounced on the SM surface and allowed a distinction between the two groups. To investigate the cause of this difference in more detail, the bound interaction partners from the SPR analysis were purified and the proteins were identified by mass spectrometry. The protein Clusterin (CLU) has been identified as by far the strongest binding partner and was significantly increased in the AD CSF samples. This result is remarkable, since in genome- wide association studies CLU was repeatedly described as a risk factor, and is currently considered as one of three key risk genes in the AD. In summary, the evidence of the high affinity of Aβ42 tetramers detected in the Project 2 and the strong interaction of CLU on SM-coated surfaces may lead to the explanation of functional relationships and CLU as a risk factor in AD. Moreover, this data result in a completely new approach as compared to the current diagnosis of Alzheimer's disease.