In vitro-Analyse des Potentials extrazellulärer Vesikel von Mesenchymalen Stromazellen für die Nierentransplantation

Abstract

Nieren-transplantierte Patienten leben im ständigen Bewusstsein einer jederzeit möglichen Abstoßung ihres Spenderorgans und mit den Nebenwirkungen der Immunsuppressiva, deren Einnahme für das Transplantat-Überleben unverzichtbar ist. Unter diesen Gesichtspunkten erscheinen Mesenchymale Stromazellen (MSC) mit ihrem regenerativen und immunmodulatorischen Potential als vielversprechende neue Therapieoption. Doch eine Zelltherapie mit MSC kann potentielle Risiken bergen, wie z.B. die maligne Entartung sowie die Induktion einer Immunantwort und dadurch beschleunigter Transplantat-Abstoßung. Diese Risikofaktoren könnten durch die Verwendung von extrazellulären Vesikeln (EV) der MSC umgangen werden. Dabei handelt es sich um kleine, Membran-umhüllte Körperchen, die von den Zellen in die Umgebung freigesetzt werden und als Signalvermittler und Transportmedium, u.a. für Proteine und RNA, fungieren können. Die EV tragen Eigenschaften ihrer Ursprungszelle und vermitteln einen Teil der MSC-typischen Effekte. Durch eine Anwendung der MSC-EV könnten demnach die positiven Effekte der MSC genutzt und gleichzeitig die angesprochenen Risiken umgangen werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte durch in vitro-Experimente eine Basis für die Testung der MSC-EV in einem Nierentransplantations-Modell in der Ratte geschaffen werden. Dazu wurden MSC und abgeleitete MSC-EV aus Ratten der Stämme Lewis und Dark Agouti isoliert. Zur Untersuchung der regenerativen Fähigkeiten der MSC-EV auf Nierenepithel-Zellen unter Bedingungen einer Transplantations-Situation wurden Rattenzellen der Linie NRK52e mit verschiedenen Induktoren - Wasserstoffperoxid (H2O2), serumfreies Medium, Vincristin und Cobaltchlorid (CoCl2) - behandelt und der Anteil geschädigter Zellen durchflusszytometrisch ermittelt. Außerdem wurden die immunmodulatorischen Eigenschaften der MSC-EV hinsichtlich der Proliferation von T-Lymphozyten und der IFNγ-Ausschüttung von Leukozyten mittels Durchflusszytometrie und ELISA analysiert. Es zeigte sich, dass die Schädigung von NRK-Zellen, die durch serumfreies Medium geschädigt wurden, durch den Einsatz von MSC-EV signifikant verringert werden konnte, wohingegen die EV keinen Einfluss auf die Schädigung durch die verbleibenden Induktoren hatten. Im Weiteren konnte demonstriert werden, dass MSC-EV im Gegensatz zu MSC selbst keinen Einfluss auf die Mitogen-induzierte Proliferation von T-Zellen haben. Die physische Anwesenheit der MSC ist demnach für diese immunmodulierende Fähigkeit notwendig. Die IFNγ-Produktion durch Leukozyten hingegen konnte durch den Zusatz von EV signifikant verringert werden. In ihrer Zusammenschau weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass MSC-EV durchaus das Potential für die Protektion geschädigter Nierenzellen besitzen und auch Teile der Immunreaktion beeinflussen können, sodass sie in einem relevanten präklinischen Tiermodell untersucht werden könnten. Die Resultate machen gleichzeitig aber auch deutlich, dass es zur Suppression der T-Zell-Proliferation noch ergänzender Mittel bedarf, wie beispielsweise die Kombination mit einem Immunsuppressivum zur Hemmung der T -Zell-Proliferation.

Renal transplant patients must cope with the knowledge that donor organ rejection can occur at any time, and with the side effects of immunosuppressive agents which are necessary for graft survival. Treatment with mesenchymal stromal cells (MSC) could address these issues due to their regenerative and immunomodulatory properties. However, cell therapy with MSC can pose potential risks such as malignancy or the induction of an immune response leading to accelerated graft rejection. These risk factors could be circumvented by the use of extra-cellular vesicles (EV) from MSC. EVs are small, membrane-bound bodies released by cells into the environment where they can act as signal mediators and transporters, acting on pro-teins and RNA, for example. The EVs carry properties of their cell of origin and could transmit some MSC-type effects. Therefore, use of MSC-EV could provide the benefits of MSC while avoiding the risks identified with whole cell application. In the present work, the MSC-EVs were tested in a rat renal transplant model in vitro. MSC and MSC-EV were isolated from Lewis and Dark Agouti rat strains and applied in order to investigate the regenerative capabilities of the MSC-EV on the kidney epithelial cell line NRK52e under different conditions. Damage inducers including hydrogen peroxide (H2O2), serum-free medium, vincristine, or cobalt chloride (CoCl2) were applied with or without addition of MSC-EV, and the proportion of damaged cells was determined by flow cytometry. In ad- dition, the immunomodulatory properties of the MSC-EV in terms of T-lymphocyte proliferation and IFNγ secretion were analyzed using flow cytometry and ELISA. It was determined that NRK cell damage mediated by serum-free medium could be significantly reduced through the use of MSC-EV, whereas the EV had no impact on the level of damage that occurred with the other inducers. In addition, it was demonstrated that MSC-EV, unlike MSC themselves, have no influence on the mitogen-induced proliferation of T cells, therefore the physical presence of the MSC is necessary for their immunomodulatory capacity. However, IFNγ production by leukocytes could be significantly reduced by the addition of EV. In summary, these results suggest that MSC-EV certainly have the potential for providing protective treatment during kidney damage and can also partially affect the immune response, making them a good candidate for study in relevant preclinical animal models. The results suggest that MSC-EV treatment might complement an immunosuppressive agent used to inhibit T cell proliferation to improve the overall outcome.