Untersuchung der Nephrogenese und Albuminurie bei der spontan hypertensiven Munich Wistar Frömter (MWF)-Ratte

Abstract

Die Munich Wistar Frömter (MWF)-Ratte stellt ein interessantes Tiermodell zur Untersuchung der Nephrogenese und hypertensiver Nierenerkrankungen dar. Männliche Tiere weisen im Vergleich zur nierengesunden Spontaneously Hypertensive Rat (SHR) eine angeborene reduzierte Nephronzahl von 27% auf. Des Weiteren entwickeln männliche MWF-Ratten eine milde spontane systemische Hypertonie, eine progressive Albuminurie und eine Glomerulosklerose. In Vorarbeiten konnte für die Entwicklung einer progressiven Albuminurie eine funktionelle Rolle für wichtige Quantitative Trait Loci (QTL) auf Rattenchromosom (RNO)6 und RNO8 bei der MWF-Ratte nachgewiesen werden. Hierbei wurde durch Transfer von SHR-RNO6 bzw. SHR-RNO8 in den MWF-Hintergrund bei den konsomen Stämmen MWF-6SHR und MWF-8SHR die Albuminurie deutlich reduziert. Darüber hinaus zeigten diese Studien, dass RNO6, aber nicht RNO8, eine wichtige kausale Rolle bezüglich des angeborenen Nephrondefizits der MWF-Ratte spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde in Studie 1 der Zeitpunkt der Fehlentwicklung von MWF-Rattennieren im Vergleich zu SHR-Rattennieren bezüglich des Nephrondefizits bestimmt und mittels Immunfluoreszenz und 3D- Rekonstruktion die Veränderungen während der embryonal-fetalen Entwicklung erfasst. Anschließend wurde der Einfluss von MWF-RNO6 auf die pränatale Nephronentwicklung untersucht. Mittels einer Microarray- und Kandidatengenanalyse wurden literaturbekannte Gene im MWF-Ratenmodell überprüft. SHR-Ratten sind in ihrer Entwicklung stärker als MWF-Ratten bzw. MWF-6SHR-Ratten retardiert, so dass für vergleichende Untersuchungen an embryonalen Nieren SHR-Embryonen eine etwa 12stündige längere Reifungszeit im Mutterleib benötigen. Die Auswertung der Whole-mount Immunfluoreszenz ergab eine tendenzielle Erniedrigung der Glomerulizahl bei MWF-Ratten am Entwicklungstag (E) 15,5 und eine signifikant erhöhte Anzahl an Ureterknospenspitzen verglichen mit SHR-Ratten an E16,0. Nach der Normierung Glomerulizahl pro Anzahl Ureterknospenendungen wurde ersichtlich, dass MWF- Rattennieren signifikant weniger Glomeruli pro einzelner Ureterknospenspitze entwickeln. Demnach besitzt der MWF-Stamm im Vergleich zum SHR-Stamm eine geringere Effizienz der Nephroninduktion. Mittels der dreidimensionalen Rekonstruktion der Ureterknospe wurden keine Verzweigungsanomalien nachgewiesen. Die Grundlage der verminderten Nephroninduktion wurde über ein Microarray-Experiment weiter entschlüsselt. Von 59 literaturbekannten Genen mit Einfluss auf die Nierenmorphogenese zeigte einzig der Hepatocyte Growth Factor (Hgf) auf RNO4 mit einer ungefähr 70% reduzierten mRNA-Expression signifikante Unterschiede bei MWF- und MWF-6SHR-Ratten an E15,5 verglichen mit SHR-Ratten an E16,0. Die Vergleichbarkeit der Hgf-mRNA-Expression bei MWF- und MWF-6SHR-Ratten demonstriert die von RNO6 unabhängige und potentielle Rolle der Hgf-Expression auf die Nephronentwicklung. In den weiteren Studien 2 und 3 des vorliegenden Dissertationsvorhabens wurde geprüft, ob die unabhängige Einflussnahme von RNO6 bzw. RNO8 der MWF-Ratte im nierengesunden und isolierten SHR-Hintergrund eine Albuminurie unter Normalbedingungen, nach 50%iger Nephronreduktion (unilaterale Nephrektomie) oder unter Nω-Nitro-L -Arginin-Methylester (L-NAME)-Behandlung bei adulten, konsomen SHR-6MWF- bzw. SHR-8MWF-Tieren induzieren kann. Die Analyse dieser konsomen Ratten schloss Untersuchungen zu strukturellen und funktionellen Nierenschäden, zum arteriellen Blutdruck, zur linksventrikulären Hypertorphie im Vergleich zwischen MWF- und SHR-Ratten sowie die Bestimmung der Gesamt-Glomerulizahl bei SHR-6MWF-Ratten mittels der „Physikal fraktionator“-Technik mit ein. Die Befunde von SHR-6MWF-Ratten, sowohl unter Normalbedingungen als auch nach unilateraler Nephrektomie zeigten, dass eine Albuminurie bei diesem Stamm nicht induziert werden konnte. Im Vergleich mit dem SHR-Stamm liegt beim konsomen SHR-6MWF-Stamm keine signifikant reduzierte Nephronzahl vor. Allerdings tragen genetische Faktoren auf RNO6 zu einer Entwicklung durch L-NAME induzierte Nierenschädigung und Albuminurie bei. Im Gegensatz hierzu konnte durch den Transfer von MWF-RNO8 in den SHR-Hintergrund zum ersten Mal der pathologische Albuminurie-Phänotyp bei konsomen SHR-8MWF-Ratten unter normalen Bedingungen induziert werden. Der erhöhte Blutdruck der SHR-8MWF- Ratte wird nicht als Ursache der Albuminurie gewertet, da der Blutdruck verglichen mit SHR signifikant niedriger war. Die unabhängige Rolle vom MWF- RNO8 QTL sowohl für Albuminurie als auch für strukturelle Nierenschäden wurde hierüber nachgewiesen.

The Munich Wistar Frömter (MWF) rat strain represents a valuable genetic model for the investigation of nephrogenesis and kidney disease. Male MWF rats exhibit an inherited nephron deficit of about 27% compared to spontaneously hypertensive rats (SHR) with low grade albuminuria. Furthermore, male MWF rats develop mild spontaneous arterial hypertension, progressive albuminuria, and glomerulosclerosis. Previous studies demonstrated that the development of albuminuria in MWF rats is influenced by two major quantitative trait loci (QTL) on rat chromosome (RNO)6 and RNO8. Thus, transfer of SHR-RNO6 or SHR- RNO8 into the MWF background protects against the development of albuminuria in the consomic strains MWF-6SHR and MWF-8SHR, respectively. In addition, RNO6, but not RNO8 influences the inherited nephron deficit in MWF rats. In study 1, the early onset of nephron endowment in MWF rats was analyzed in comparison to SHR by whole-mount immunohistochemistry and three-dimensional reconstruction. Secondly, the influence of SHR-RNO6 in the consomic strain MWF-6SHR on nephron development was investigated. By microarray analysis gene expressions of candidate genes previously implicated in nephron development were evaluated. The characterisation of early-stage embryonic development of the parental strains demonstrated that SHR animals were developmentally retarded. Thus, the developmental stages of SHR at embryonic day (E)16.0 and of consomic MWF-6SHR rats at E15.5 were defined as stage-matched and selected for studies. The investigation of embryonic glomerular number revealed a trend towards reduced glomerular numbers and showed significantly higher numbers of ureteric bud (UB) tips in MWF rats at E15.5 compared to the stage-matched reference strain SHR at E16.0. When the number of glomeruli per kidney was related to the number of UB tips per kidney a significantly reduced ratio in MWF rats compared to SHR was observed. Thus, the efficiency of nephron induction in the MWF strain appeared to be reduced compared to SHR. The three- dimensional reconstruction of the UB by merged Z-stack channel of FITC staining revealed a similar architecture of the ureteric tree between the parental strains. Subsequently, the underlying mechanisms of reduced nephron induction were analysed by a gene expression analysis experiment. Overall 59 candidate genes involved in nephrogenesis or organized in known pathways for nephron development were selected by a systematic literature search. Only the hepatocyte growth factor (Hgf) on RNO4 showed a significant differential mRNA expression. Compared to the stage-matched SHR strain at E16.0, MWF and MWF- 6SHR rats at E15.5 exhibited a reduced Hgf expression of about 70% (P<0.004). The results identified Hgf as a potential candidate for alterations in nephrogenesis. In study 2 and 3 it was tested whether the transfer of RNO6 or RNO8 of the MWF strain into the albuminuria-resistant SHR background induces albuminuria in consomic SHR-6MWF or SHR-8MWF animals either under standard conditions, after unilaterally nephrectomization (Nx), or under NG- nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) treatment. Furthermore, renal structural changes such as glomerulosclerosis and tubulointerstitial damage index, systolic blood pressure and left ventricular hypertrophy of parental and the consomic strains and the total glomerular number per kidney by a physical fractionator technique in consomic SHR-6MWF rats were analyzed. The results demonstrated that in SHR-6MWF rats albuminuria was not inducible under Sham and unilateral Nx conditions, respectively. Furthermore, the nephron number in SHR-6MWF rats was not significantly reduced compared to SHR. However, the presented results demonstrated that SHR are very susceptible to L-NAME treatment and that this vulnerability is aggravated by introgressing RNO6 from the MWF strain into their genome. In contrast to SHR-6MWF rats, transfer of RNO8 from MWF into the resistant recipient background of SHR resulted in an induction of albuminuria already under normal conditions. This significant increase of albuminuria in SHR-8MWF rats was not attributable to higher blood pressures, since these animals showed even lower blood pressures compared to SHR. Taken together, the latter study confirmed the independent genetic link between QTL on RNO8 and albuminuria.