dc.contributor.author
Gehne, Nora
dc.date.accessioned
2018-06-08T02:01:43Z
dc.date.available
2017-09-27T12:53:21.169Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13945
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-18142
dc.description.abstract
Claudine (Cldn) sind transmembranale tight junction (TJ)-Proteine, welche den
parazellulären Spalt in Epithelien und Endothelien abdichten. Durch
Interaktionen mit Claudinen in derselben Membran (cis) und in der
gegenüberliegenden Membran benachbarter Zellen (trans) regulieren sie den
parazellulären Stoffaustausch. TJ-Umbau durch Endozytose und Neueinbau von
Claudinen sind essentielle Regulatoren der TJ-Zusammensetzung, worüber die
Barriereeigenschaften von Zellschichten bestimmt werden. In dieser Arbeit
wurde der Mechanismus der cross-over Endozytose charakterisiert, bei welcher
Claudine aus der gegenüberliegenden Membran in die Nachbarzelle endozytiert
werden, zusammen mit dem eigenen Claudin. Aminosäuresubstitutionen in der
zweiten extrazellulären Schleife von Cldn5 (Cldn5F147A und Cldn5Q156E) führten
in MDCK-II-Zellen zu gestörten cis- und trans-Interaktionen und zu
beeinträchtigten Barriereeigenschaften, die mit reduzierter Bildung von TJ-
Strängen einhergingen. Es wurde gezeigt, dass cross-over Endozytose von
Claudin-Claudin-Interaktionen abhängt, da Cldn5F147A und Cldn5Q156E wesentlich
seltener cross-over endozytiert wurden als Cldn5. Mittels stimulated emission
depletion (STED)-Mikroskopie wurden doppelwandige, Cldn5-haltige Vesikel
nachgewiesen. Die äußere Membran dieser Vesikel war in Kontakt mit dem
Zytosol, wie durch selektive Proteolyse des zytoplasmatischen Materials
bewiesen wurde. Cross-over endozytiertes Cldn5 lokalisierte dagegen im
Vesikelinneren. In diesen Vesikeln kolokalisierten verschiedene Claudin-
Subtypen sowie Occludin. Es handelt sich somit um einen Prozess, über den
zusammenhängende Membranbereiche, nicht aber einzelne Claudine endozytiert
werden. Die cross-over Endozytose von Cldn5 war abhängig von
Clathrin/Adapterprotein 2 sowie von Caveolin/Cholesterol, aber unabhängig von
Dynamin. Außerdem wurde der Abbau cross-over endozytierter Vesikel über den
Autophagie/Lysosom-abhängigen Weg nachgewiesen. Cross-over endozytiertes Cldn5
kolokalisierte mit Lysomen sowie mit Autophagosomen-Markern (LC3 und ATG16L).
Die Inhibition des lysosomalen Abbaus führte zur Akkumulation von cross-over
endozytiertem Cldn5. ATG16L ist bekanntermaßen an der Autophagosomenbiogenese
beteiligt und ist typisch für frühe Autophagosomen. Die Präsenz von ATG16L,
sowie GFP-LC3 in cross-over endozytierten Vesikeln deutet auf eine direkte
Rolle der autophagosomalen Maschinerie für die Endozytose von in die TJs
integrierten Claudinen hin. Die Internalisierung von Claudin-abgeleitetem
Peptiden erfolgte teilweise über cross-over endozytierte Vesikel, also nach
Bindung an Claudine innerhalb der TJ, aber auch über die Bindung an freie
Claudine außerhalb der TJs. Insgesamt wurde ein Mechanismus charakterisiert,
welcher im Kontext früherer Untersuchungen generelle Bedeutung für das
Remodeling von Zellkontakten und die Endozytose trans-interagierender
Transmembranproteine aufzeigt. Als Mittel zur Regulierung der Permeabilität
von Zellbarrieren spielt cross-over Endozytose von Claudinen eine wichtige
Rolle unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.
de
dc.description.abstract
Claudins (Cldns) are transmembranous tight junction (TJ) proteins that seal
the paracellular cleft in epithelia and endothelia. They regulate the
paracellular solute exchange through Cldn-Cldn interactions along the same
membrane (cis) and with Cldns in neighboring cells (trans). TJ-remodeling via
endocytosis and incorporation of different Cldns is an essential regulator of
TJ-composition which determines the barrier properties of a cell layer. In
this study, cross-over endocytosis was characterized, a mechanism during which
Cldns are endocytosed into the neighboring cell together with the cell’s own
Cldns. Amino acid substitutions in the second extracellular loop of Cldn5
(Cldn5F147A, Cldn5Q156E) led to reduced cis- and trans-interactions, and to
impaired barrier function in MDCK-II cells which was accompanied by reduced
TJ-strand formation. Cross-over endocytosis was shown to depend on Cldn-Cldn
interactions, as Cldn5F147A und Cldn5Q156E were less frequently cross-over
endocytosed than wildtype Cldn5. Using stimulated emission depletion
(STED)-microscopy the existence of Cldn5-containing, double membrane vesicles
was demonstrated. The outer membrane of this vesicle was oriented towards the
cytosol, which was confirmed by selective proteolysis of cytoplasmic material.
Cross-over endocytosed Cldn5 located towards the lumen of the vesicle.
Different Cldn-subtypes as well as occludin were found to colocalize with
these vesicles. Therefore cross-over endocytosis is a process that
internalizes coherent membrane sections, but not individual Cldn molecules.
Cross-over endocytosis depended on clathrin/adapter protein 2 and
caveolin/cholesterol but was independent of dynamin. Moreover, degradation of
cross-over endocytosed vesicles via the autophagy/lysosomal pathway was
demonstrated. Cross-over endocytosed Cldn5 was shown to colocalize with the
lysosome, as well as with autophagy markers (LC3, ATG16L). Inhibition of
lysosomal degradation led to an accumulation of cross-over endocytosed Cldn5.
ATG16L is known to be involved in autophagosome biogenesis and is typically
found in early stages of autophagosome formation. The presence of ATG16L and
GFP-LC3 in cross-over endocytosed vesicles suggests a direct role for the
autophagosomal machinery in the endocytosis of Cldns integrated in the TJs.
Internalization of Cldn-derived peptides occurred via binding of the peptides
to Cldns inside the TJs and to free Cldns outside the TJs. In conclusion this
study characterized a mechanism that, in the context of existing knowledge,
has relevance for the remodeling of cell contacts and for the endocytosis of
transmembrane proteins with strong associations with the opposing membrane. As
a means for the regulation of the permeability of cell barriers cross-over
endocytosis plays an important role for physiologic and pathologic conditions.
en
dc.format.extent
119 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Tight Junctions
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::571 Physiologie und verwandte Themen
dc.title
Untersuchungen zu Endozytose und Interaktionen von Tight Junction Proteinen
dc.contributor.contact
ng.diss@gehne.de
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Ingolf E. Blasig
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Oliver Daumke
dc.date.accepted
2017-06-29
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000105110-9
dc.title.translated
Investigation of Endocytosis and Interactions of Tight Junction Proteins
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000105110
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000022109
dcterms.accessRights.dnb
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open access