The impact of the U2AF35 zinc finger domains and cancer-associated mutations on protein function

Abstract

Splicing of pre-mRNA is a tightly regulated process that has to be performed very accurately to ensure the generation of functional mRNAs. The accuracy is accomplished by the recognition of conserved RNA sequences like the splice sites at the exon-intron boundaries. The U2 auxiliary factor 35 (U2AF35) is a splicing factor involved in the initial steps of spliceosome assembly. Together with U2AF65, U2AF35 builds the heterodimer U2AF that determines the 3’ splice site (3’ ss). The RNA contacting domain in U2AF35 was just recently characterized for the yeast homolog U2AF23. Assignment of the crystal structure and in vitro binding studies of yeast U2AF23 revealed that the two zinc finger (ZnF) domains cooperatively recognize a 4-bases long RNA sequence representing the 3’ ss with the conserved AG dinucleotide in the center. The ZnFs of U2AF35 got further attention since mutations therein were implicated in hematopoietic disorders. In this study, we have analyzed key functionalities of mammalian U2AF35 ZnFs in cell based approaches and could verify and extend the observations made for the yeast homolog U2AF23. Protein stability assays revealed that ZnF2 is required for U2AF35 protein stability. Furthermore, the ZnF2 is needed for a stable U2AF heterodimer complex formation. Knockdown and complementation assays showed that both ZnFs are indispensable for splicing regulation of U2AF35-dependent exons. The observations for U2AF35 could be confirmed with the highly conserved paralog U2AF26 and these results also demonstrate that U2AF26 can functionally substitute for U2AF35 in vivo. The importance of the ZnF2 was further verified with a naturally occurring splice variant of U2AF26 which lacks the largest part of the ZnF2 (U2AF26ΔE7). In contrast to U2AF26fl, U2AF26ΔE7 localizes into the cytoplasm and is upregulated in activated primary mouse T cells. An MS2-based reporter assay was used to elucidate the impact of U2AF26ΔE7 on cytoplasmic RNAs and revealed that U2AF26ΔE7 increases the translation of a reporter gene when tethered to its 5’UTR. To identify endogenous U2AF26ΔE7 targets, mouse T cells with a stable U2AF26ΔE7 expression were generated. A targeted approach revealed an elevated surface expression of the T cell marker Ly6a in the U2AF26ΔE7 expressing cells. Further experiment revealed that the elevated Ly6a surface expression observed in U2AF26ΔE7 expressing cell might be regulated on the level of translation as well as mRNA stability. We then focused our investigations on the U2AF35 ZnF2 and analyzed the consequences of the AML-associated Q157R and Q157P mutations therein. Interestingly, we discovered that the c.470A>G mutation that causes the Q157R substitution in addition generates an alternative 5’ ss. Usage of the alternative 5’ ss leads to the deletion of four amino acids within the ZnF2 creating the Q157Rdel variant. Genome wide examination of splicing targets and binding motifs of the Q157P, Q157R and Q157Rdel mutants resulted in considerable differences in targeted exon caused by different 3’ ss binding preferences of the mutants. Differences in splicing regulation were also observed in RNA sequencing analysis of AML patients carrying the Q157R or Q157P mutation, suggesting that the mutations alter binding specificities of U2AF35. Furthermore, we identified Q157Rdel mRNA expression in the RNA sequencing data of c.470A>G patients. Comparison of Q157Rdel- and Q157R-specific splicing in cells and in patients demonstrated that the Q157Rdel variant likely contributes to the missplicing observed in the Q157R patients. Splicing is an essential and highly controlled pre-mRNA processing step whose misregulation causes many diseases. U2AF35 plays a tremendous role in splicing regulation by the initial recognition of intron-exon boundaries in a sequence specific manner. With this study, we contributed to the functional characterization of the RNA- recognizing domains in U2AF35 and deciphered the consequences of disease- associated mutations therein.

Das Spleißen von prä-mRNA ist ein stark regulierter Prozess und erfordert eine enorm hohe Präzision um die Herstellung von funktionalen mRNAs zu gewährleisten. Die Präzision wird durch das Erkennen von konservierten RNA- Sequenzen, wie beispielsweise den Spleißstellen, erreicht. Der Spleißfaktor U2AF35 (U2 auxiliary factor 35) übernimmt eine wesentliche Rolle in der Spleißinitiation. U2AF35 bildet zusammen mit dem Spleißfaktor U2AF65 das U2AF Heterodimer, welches die 3’-Spleißstelle erkennt und dadurch den Intron-Exon- Übergang markiert. Die RNA-bindende Domäne in U2AF35 wurde vor kurzem für das homologe Protein in Hefe (U2AF23) beschrieben. Die Bestimmung der Kristallstruktur und die Durchführung von RNA Bindestudien für U2AF23 ergaben, dass beide Zinkfingerdomänen gemeinsam an eine 4 Basen lange Sequenz binden. Die gebundene Sequenz stellt die 3’-Spleißstelle dar und enthält das konservierte AG-Dinukleotid in der Mitte. Die Zinkfingerdomänen von U2AF35 erlangten weitere Aufmerksamkeit durch die Identifizierung von darin vorkommenden Punktmutationen. Mutiertes U2AF35 führt zu veränderten Spleißmustern und trägt damit zur Entstehung von hämatopoetischen Erkrankungen bei. Ein Ziel dieser Studie war die funktionelle Untersuchung der Zinkfingerdomänen von dem in Säugern vorkommenden U2AF35. Mit Hilfe von zellkulturbasierten Experimenten konnten die Erkenntnisse, die für das U2AF35 Homolog in Hefe erlangt wurden, für das murine U2AF35 verifiziert und erweitert werden. Die Untersuchung der Proteinstabilität von U2AF35 ergab, dass der zweite Zinkfinger (ZnF) für die Stabilität von U2AF35 benötigt wird. Darüber hinaus trägt der zweite ZnF zur Bildung eines stabilen U2AF- Heterodimers bei. Die Substitution des endogenen volle Länge U2AF35-Proteins mit ZnF-deletierten U2AF35-Proteinen ergab, dass beide ZnF für die Spleißregulation von U2AF35-abhändigen prä-mRNAs benötigt werden. Die beschriebenen Erkenntnisse wurden für das U2AF35-verwandte Protein U2AF26 bestätigt und zeigen auch, dass U2AF26 und U2AF35 äquivalente Funktionen in Zellen haben. Die Bedeutung des zweiten ZnFs wurde außerdem mit einer natürlich vorkommenden Spleißvariante von U2AF26 bestätigt, bei der durch die Exklusion von Exon 7 (U2AF26ΔE7) große Teile des zweiten ZnFs fehlen. Im Gegensatz zur Lokalisation des volle Länge U2AF26 in den Kern, lokalisiert U2AF26ΔE7 in das Zytoplasma und ist verstärkt exprimiert in aktivierten primären T-Zellen aus der Maus. Um die Funktion des zytoplasmatischen U2AF26ΔE7 aufzuklären, wurde eine MS2-basierte Reportergenanalyse durchgeführt, die zeigt, dass U2AF26ΔE7 die Translation des Reportergens erhöht, wenn es zum 5’-Ende des untranslatierten Bereichs rekrutiert wird. Als nächstes wurde eine murine T-Zelllinie mit stabiler U2AF26ΔE7 Überexpression erzeugt, um mögliche endogene U2AF26ΔE7 Ziel-mRNAs zu identifizieren. Basierend auf den Vorergebnissen wurde die Proteinexpression von einigen T-Zelloberflächenmarkern untersucht. Diese Untersuchung ergab eine erhöhte Oberflächenexpression des Proteins Ly6a auf den U2AF26ΔE7-exprimierenden Zellen, welche durch eine erhöhte Ly6a mRNA Stabilität und eine leicht verstärkte Translation reguliert zu sein scheint. Wir konzentrierten unsere Untersuchungen auf den zweiten ZnF von U2AF35 und untersuchten die Konsequenzen der darin vorkommenden AML-assoziierten Punktmutationen Q157R und Q157P. Interessanterweise, führt die c.470A>G Mutation, zusätzlich zur Q157R Substitution, zur Verstärkung einer sich direkt dahinter befindenden alternativen 5’-Spleißstelle. Zusätzlich zu der Q157R-Substitution führt die Nutzung der alternativen 5’-Spleißstelle zur Deletion von vier Aminosäuren und bildet dadurch die Q157Rdel Spleißvariante von U2AF35. Genomweite Untersuchungen von Ziel-prä-mRNAs und darin enthaltenen Spleißstellen ergaben, dass die Q157P-, Q157R- und Q157Rdel-Mutanten bestimmte 3’-Spleißstellen bevorzugt binden und dadurch das Spleißen unterschiedlicher prä-mRNAs regulieren. Unterschiedliches Spleißen von prä-mRNAs wurde auch in genomweiten Untersuchungen von AML-Patienten mit den Q157R- und Q157-Mutation gefunden. Dieses deutet auf eine veränderte Bindungsspezifität von U2AF35 hin, die durch die Mutationen verursacht wird. Des Weiteren ist von Bedeutung, dass die Q157Rdel-Spleißvariante auch in AML-Patienten mit der c.470A>G Mutation exprimiert ist. Der Vergleich von Spleißunterschieden, verursacht durch die Q157R- und die Q157Rdel-Mutante in Zellen und in Patienten, deutet darauf hin, dass die Q157Rdel-Spleißvariante zum abnormalen Spleißen in Q157R-Patienten beiträgt. Spleißen ist ein essentieller und stark regulierter Schritt während der prä-mRNA-Prozessierung dessen Deregulierung viele Krankheiten verursacht. Zu Beginn der Spleißreaktion markiert U2AF35 sequenzspezifisch den Intron- Exon-Übergang und ist deswegen enorm wichtig für die Spleißregulation. Mit dieser Studie tragen wir zur funktionellen Charakterisierung der RNA-bindenden Domänen in U2AF35 bei und helfen, die Auswirkungen der darin vorkommenden krankheitsassoziierten Mutationen, zu verstehen.