Untersuchung neuer Regulatoren der Glukose-stimulierten Genexpression

Abstract

Das Protein Carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) ist ein Glukosestimulierter Transkriptionsfaktor und ein wichtiger Regulator des Glukose- und Fettstoffwechsels. Die höchste Expression von ChREBP findet sich in der Leber. Durch hohe Glukosekonzentrationen in der Zelle wird ChREBP, über die Translokation in den Zellkern, aktiviert und induziert die Expression glykolytischer und lipogener Zielgene. Dieser Arbeit vorausgehende Experimente in primären Maushepatozyten haben gezeigt, dass die Depletion der Prolylhydroxylase Egl-nine hypoxia-inducible factor 3 (EGLN3) zu einer reduzierten Expression von ChREBP-Zielgenen führt. EGLN3 ist eine von drei Isoformen einer Enzymfamilie, deren enzymatische Funktion darin besteht, Prolinreste bestimmter Zielproteine zu hydroxylieren. Daraus leitete sich die Hypothese ab, dass EGLN3 ein neuer Regulator der ChREBP-Aktivität ist und diese Regulation über Prolinhydroxylierung vermittelt wird. Zunächst identifizierte die vorliegende Arbeit mittels Co-Immunopräzipitation eine physikalische Protein-Protein-Interaktion zwischen ChREBP und EGLN3. Diese Interaktion konnte gleichermaßen für überexprimiertes ChREBP und EGLN3 in HEK- Zellen, als auch für die endogenen Proteine in primären Hepatozyten und murinem Lebergewebe nachgewiesen werden. Anschließend zeigte eine massenspektrometrische Analyse verschiedene hydroxylierte Prolinreste in überexprimiertem und endogenem ChREBP-Protein. In vitro in primären Hepatozyten und in vivo in der Mausleber war die funktionelle Konsequenz einer verminderten EGLN3-Expression die reduzierte Expression von ChREBP-Protein und dessen Zielgenen. In primären Hepatozyten konnte der Effekt der EGLN3-Depletion, die reduzierte Expression von ChREBP-Zielgenen, durch Zugabe von ektop-exprimiertem ChREBP wieder aufgehoben werden. Diese Beobachtung bestätigte, dass die Herunterregulation von ChREBP-Zielgenen nach Depletion von EGLN3 tatsächlich durch ChREBP vermittelt ist. Zusammenfassend hat die vorliegende Arbeit eine physikalische Interaktion zwischen den beiden Proteinen ChREBP und EGLN3 nachgewiesen und lässt eine Proteinmodifikation in Form von Prolinhydroxylierung von ChREBP durch EGLN3 vermuten. Die gewonnenen Erkenntnisse zur funktionellen Konsequenz dieser Beeinflussung deuten auf eine Stabilisierung und Aktivierung von ChREBP durch Prolinhydroxylierung hin. Es ist bekannt, dass eine gesteigerte Lipidsynthese in der Leber zu Erkrankungen wie hepatischer Steatose und Insulinresistenz führen kann. Eine Verminderung der ChREBP-induzierten hepatischen Lipidsynthese durch pharmakologische EGLN3-Inhibierung könnte eine neue therapeutische Interventionsmöglichkeit für diese Erkrankungen darstellen.

The carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) is a glucose- stimulated transcription factor that regulates carbohydrate and lipid metabolism. The highest expression of ChREBP can be found in the liver. High cellular glucose concentrations initiate translocation of ChREBP into the nucleus, where it binds to DNA and induces the expression of glycolytic and lipogenic target genes. Previous experiments using primary murine hepatocytes showed that depletion of the prolyl hydroxylase egl-nine hypoxia-inducible factor 3 (EGLN3) leads to a reduced expression of ChREBP target genes. EGLN3 is one isoform of an enzyme family that hydroxylates proline residues of certain target proteins. Hence it is hypothesized that EGLN3 is a novel regulator of ChREBP activity and that this regulatory function is mediated through proline hydroxylation. The present study identified a physical protein-protein interaction between ChREBP and EGLN3 by using co- immunoprecipitation. This interaction was verified for both overexpressed ChREBP and EGLN3 in HEK cells as well as endogenous protein levels in primary hepatocytes and murine liver tissue. A subsequent mass spectrometric analysis revealed different hydroxylated proline residues in overexpressed and endogenous ChREBP protein. Experiments using primary hepatocytes in vitro and analysis of the mouse liver in vivo demonstrated that diminished EGLN3 expression led to a reduced expression of ChREBP protein and ChREBP target genes. The effect of EGLN3 depletion on the ChREBP target gene expression in primary hepatocytes was rescued by ectopic expression of ChREBP. This observation indicates that EGLN3 depletion-induced downregulation of ChREBP target genes is in fact mediated by ChREBP. In summary, this study detected a physical interaction between ChREBP and EGLN3. Furthermore, these results suggest an EGLN3-mediated proline hydroxylation of ChREBP. These novel findings of ChREBP regulation indicate a stabilization and activation of ChREBP caused by proline hydroxylation. It is known that increased lipid synthesis in the liver can lead to diseases like hepatic steatosis and insulin resistance. Pharmacological EGLN3-inhibition could be used as a new therapeutic intervention in order to reduce ChREBP-induced hepatic lipid synthesis and treat these diseases.