Struktur-Funktions-Untersuchungen zur Hinge-Region in Glykoproteinhormon- Rezeptoren

Abstract

Zusammen mit dem Thyreotropinrezeptor (TSHR), bilden der Follitropinrezeptor (FSHR) und der Lutropinrezeptor (LHR) die Untergruppe der Glykoproteinhormon- Rezeptoren (GPHR), welche zu den rhodopsinähnlichen GPCR zählt. Die GPHR bilden eine oligomere Signalisierungseinheit, bei der die Signalweiterleitung durch intermolekulare Interaktionen mit benachbarten Rezeptoren und endogenen Liganden erfolgt. Eine Beteiligung an diesem Prozess wird von der Hinge-Region vermutet, welche die extrazelluläre ligandbindenden leucine-rich repeat Domäne (LRRD) mit der transmembranären Serpentindomäne (SD) verbindet. Um den molekularen Mechanismus der Signalvermittlung zu verstehen, wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig das strukturelle Profil der Hinge-Region des TSHR und des LHR untersucht. Mittels breit angelegter Expressionsstudien in E.coli und P.pastoris, sowie einem proteinfragmentbasiertem Hochdurchsatz- Screening (ESPRIT) konnte gezeigt werden, dass die Hinge-Region funktionell essentielle strukturierte Abschnitte aufweist, diese jedoch aber nicht strukturautonom als Domäne vorliegen. Vielmehr führen intra- und intermolekulare Kontakte von benachbarten Domänen zur Ausbildung aktiver Konformationen, welche zur Signalamplifikation führen. Weiterhin konnten durch die Einführung von Alanin bzw. Prolinmutationen in den Exon10-kodierenden Bereich der Hinge-Region zwei potentiell helikale Strukturelemente, sowie eine signalisierungssensitive Region innerhalb der LHR Hinge-Region gefunden werden, welche in unterschiedlicher Weise mit den Hormonen Lutropin (LH) und Choriongonadotropin (CG) interagieren. Mit Hilfe von Mutationen und Deletionen innerhalb der LHR Hinge-Region konnte desweiteren gezeigt werden, dass nicht spezifische Aminosäureeigenschaften, sondern vielmehr Strukturmerkmale funktionsrelevant sind und im Fall einer strukturellen Störung (Deletion) Funktionen im Signalisierungsmechanismus kompensiert werden. Für den LHR konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass für die beiden Hormone LH und CG unterschiedliche molekulare Aktivierungsmechanismen im Zusammenhang mit der Hinge-Region vorliegen. Dabei wurde die intramolekulare Aktivierung durch LH- und die intermolekulare Aktivierung durch CG-Stimulation nachgewiesen. Die beleuchteten molekularen Determinanten für die Rezeptoraktivierung liefern ebenfalls eine plausible Erklärung für die Fehlfunktion einer natürlich vorkommenden Deletionsmutante bei der die LHR Hinge-Region um 27 Aminosauren (Exon10) verkürzt ist. Diese Arbeit zur Hinge-Region der GPHR bietet somit eine Grundlage für die Formulierung eines erweiterten Aktivierungsmodells für den LHR unter Einbezug kooperativer Effekte und beschreibt zum ersten Mal den Einfluss der Hinge-Region in dem ablaufenden Aktivierungsprozess.

Together with the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), the follitropin receptor (FSHR) and the lutropin receptor (LHR) constitutes the subgroup of glycoprotein-hormone receptors (GPHR), which belongs to the rhodopsin like GPCR. The GPHR act as oligomeric signaling units in which signal transduction is mediated by intermolecular interaction of neighboring receptors and endogenous ligands. It is speculated that the intermolecular cooperativity is mainly influenced by the hinge region, a key participant for signal transduction connecting the extracellular ligand binding leucine-rich repeat domain (LRRD) and the transmembrane spanning region (SD). This work addresses the role of the hinge region in this process by elucidation of the structure- function relationship during the signal initiation and transduction. One goal of this work is the exploration of its structural profile. To reveal insights in the folding properties of extracellular TSHR fragments, different expression strategies (E. coli and P. pastoris) has been performed. For extensive expression studies a DNA library based high-throughput screen (ESPRIT) was performed. TSHR hinge region fragments with an enhanced stability could be prepared for further structural investigations. Initial experiments revealed that the hinge region cannot be isolated as an autonomously self- folding domain. It is likely that the hinge region needs additional parameters like tight intra- or intermolecular contact partners to achieve the correct fold. A second goal is to reveal the molecular reasons for the different signaling behavior of lutropin (LH) and choriongonadotropin (CG) at the lutropin receptor (LHR). To elucidate the structure-function relationship a LHR mutant lacking 27 amino acids (exon10) within the hinge region was investigated. Since proline but not alanine mutations impair the LHR function it is causative that signal transduction is mediated rather by two identified structural elements than by specific amino acid motifs. Moreover it could be shown that LH mediated receptor activation is strongly related to a sulfated tyrosine within the Tyr331 region, while CG activation is less dependent and activates the receptor by interaction with the structural element within exon10 of the LHR hinge region. A third goal of this work is the elucidation of the differences between LH and CG induced function by investigation of intermolecular cooperativity at the LHR. For this purpose the reported LHR mutant lacking exon10 has been investigated in an experimental setup, in which the combination of signal deficient LHR mutants and hormone binding deficient ones were tested for intermolecular receptor activation. Fluorescence cross- correlation spectroscopy (FCCS) excluded monomerization of LHR-delEx10 as reason for functional differences. Moreover, it could be shown that LH may exclusively stimulate the targeted LHR by intramolecular activation, while CG is able to induce intermolecular activation too.