Substratdimerisierung und Aβ-Produktion im γ-Sekretase-Komplex

Abstract

Das toxische Aβ42-Peptid gilt als kausatives Agens der Alzheimer-Krankheit. Es wird von der γ-Sekretase durch sukzessive Schnitte aus dem Vorläufermolekül APP-CTF (C-terminales Fragment des Amyloidvorläuferproteins) produziert. Die Dimerisierung des APP-CTFs über die GxxxG-Motive in seiner Transmembransequenz (TMS) ist einer der entscheidenden Faktoren für die Länge der produzierten Aβ- Peptide. Ein hoher Dimerisierungsgrad des Substrats behindert die sequentielle Proteolyse, so dass verstärkt längere, toxische Aβ-Peptide gebildet werden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung des Oligomerisierungszustandes und der Konformation des rekombinant hergestellten APP-CTFs C100. C100 wird häufig für in vitro γ-Sekretase-Tests verwendet, wurde bislang aber nicht näher charakterisiert. Hier konnte mittels CD- Spektroskopie und „continuous wave“-ESR-Messungen gezeigt werden, dass in SDS- Micellen rekonstituiertes C100 eine langlebige α-helikale Konformation annimmt und hauptsächlich in Form von Monomeren und Dimeren vorliegt. Damit ist es sehr gut geeignet für in vitro-Tests. Einige γ-Sekretase-Modulatoren (GSM) hemmen die Produktion von Aβ42, indem sie an die Oberfläche der APP-TMS binden und die Dimerisierung von APP-CTF inhibieren. Anhand eines molekularen Modells wurde postuliert, dass diese Bindung der GSM an APP-CTF über die flache Helixoberfläche vermittelt wird, die die GxxxG-Motive ausbilden. In dieser Arbeit konnte mittels Oberflächenplasmonresonanz gezeigt werden, dass der GSM Sulindacsulfid spezifisch an C100 bindet. Diese Bindung ist bei der C100 -GxxxG-Mutante G33I verringert, was die These einer Interaktion über die GxxxG-Oberfläche stützt. Zudem bindet Sulindacsulfid verstärkt an C100-Dimere. Dies impliziert, dass dieser GSM seine Aβ42-senkende Wirkung unter anderem durch die Monomerisierung des APP-CTF ausübt. Die meisten Presenilinmutanten verstärken die Produktion des toxischen Aβ42-Peptids. GxxxG-Mutanten des APP- CTF führen dagegen zu einer erhöhten Produktion verkürzter, nicht-toxischer Aβ-Peptide wie Aβ38, da sie das APP-CTF monomerisieren und so die sequentielle Proteolyse unterstützen. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Effekten betrachtet. Es wurden 7 Mutanten des Presenilin 1 (PS1) hinsichtlich ihrer Aβ-Produktion mittels ELISA charakterisiert. Davon führen 5 Mutanten schon früh, zwischen 32 und 45 Jahren, zum Ausbruch der Alzheimer-Krankheit („early-onset“, eo-FAD-Mutanten). Die anderen beiden Mutanten haben einen Krankheitsbeginn von etwa 58 Jahren („late onset“, lo-FAD-Mutanten). Die meisten der analysierten Mutanten hemmen die sequentielle Proteolyse, so dass weniger Aβ38 und mehr Aβ42 entsteht. Kombiniert man PS1-FAD-Mutanten und GxxxG-Mutanten des APP-CTF, so heben sich ihre Effekte auf die Aβ-Produktion teilweise auf. Die schwache GxxxG-Mutation G33A kann die sequentielle γ-Sekretase-Prozessierung bei PS1-Wildtyp und lo- FAD-Mutanten erhöhen, was zu einer verstärkten Aβ38- und einer verringerten Aβ42-Produktion führt. Auf eo-FAD-Mutanten hat diese Mutation jedoch nur einen schwachen Effekt. Stärkere GxxxG-Mutationen wie G33I können aber auch bei diesen Mutanten die γ-Sekretase-Prozessierung beeinflussen wie bei PS1-wt. Damit ist die GxxxG-vermittelte Dimerisierung des APP-CTFs der entscheidende Faktor für die Aβ-Produktion. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass Substanzen, die das Monomer:Dimer-Verhältnis des APP-CTFs erhöhen, erhebliches therapeutisches Potential als Alzheimer-Medikamente haben. Nach dem hier entwickelten Modell ist zur Produktion kurzer Aβ-Spezies eine relativ große Flexibilität des Enzym-Substrat-Komplexes aus Presenilin und APP-CTF notwendig. Die Beweglichkeit der Proteine kann unter anderem durch PS-FAD- Mutanten oder durch die Substratdimerisierung eingeschränkt werden. Damit trägt diese Arbeit zum besseren Verständnis des Mechanismus der Aβ-Synthese bei. Viele verschiedene Faktoren können Veränderungen in der Konformation des Enzym-Substrat-Komplexes induzieren und so die Aβ-Prozessierung beeinflussen. Dies könnte erklären, warum sich der Krankheitsverlauf bei Alzheimer-Patienten über mehrere Jahrzehnte hinziehen kann.

The toxic Aβ42 peptide is held to be the causative agent of Alzheimer’s Disease (AD). It is produced from its precursor APP-CTF (amyloid precursor protein C-terminal fragment) by γ-secretase through stepwise cleavage. The dimerization of the APP-CTF via the GxxxG motifs in its transmembrane sequence (TMS) is one of the determining factors for the length of the produced Aβ peptides. A high level of substrate dimerization impedes its sequential proteolysis, leading to the increased production of longer, toxic Aβ peptides. One focus of this thesis was to investigate the oligomeric state and conformation of the recombinantly expressed APP-CTF C100. C100 is frequently used in in vitro γ-secretase assays but has not been well characterized so far. Here, using CD spectroscopy and continuous wave ESR measurements, it is shown that C100 reconstituted in SDS micelles adopts a long-lived α-helical conformation and is present mostly in the form of monomers and dimers. Thus, it is very suitable for in vitro assays. A number of γ-secretase modulators (GSMs) lower the production of Aβ42 by binding to the APP-TMS surface and inhibiting APP-CTF dimerization. On the basis of a molecular model it was postulated that the interaction of these GSMs with the APP-CTF requires the flat helix surface formed by the GxxxG motifs. Using surface plasmon resonance, it is shown here that the GSM sulindac sulfide binds specifically to C100. This interaction is lowered for the C100 GxxxG mutant G33I, which supports the theory of GSM binding via the GxxxG surface. Furthermore, sulindac sulfide binds preferentially to C100 dimers. This implies that this GSM achieves Aβ42 lowering partially by the monomerization of APP-CTF. Most presenilin mutants increase the production of the toxic Aβ42 peptide. GxxxG mutants of the APP-CTF, on the other hand, increase the production of shorter, non-toxic Aβ peptides such as Aβ38 by momomerizing the APP-CTF, thereby facilitating its sequential proteolysis. This study analyzes for the first time the interplay between these two effects. 7 mutants of presenilin 1 (PS1) were characterized as to their Aβ production using ELISA. 5 of these mutants cause early-onset familial AD (eo-FAD mutants, age of onset 32 to 45 years). The other two mutants have an age of onset of approximately 58 years, making them late-onset (lo-)FAD mutants. Most analyzed mutants inhibit sequential proteolysis, leading to an enhanced Aβ42 production at the expense of Aβ38. When PS1-FAD mutants and APP-CTF GxxxG mutants are combined, their effects on Aβ production partially neutralize each other. The mild GxxxG mutation G33A enhances the sequential proteolysis by PS1-wt or lo-FAD mutants, increasing Aβ38 and decreasing Aβ42 production. On eo-FAD mutants, G33A exhibits only weak effects. Stronger GxxxG mutations such as G33I, however, can also influence γ-secretase processing these mutants. Thus, the GxxxG-mediated APP- CTF dimerization is the decisive factor for Aβ production. These results support the hypothesis that substances which increase the monomer:dimer ratio of APP-CTF have considerable therapeutic potential as drugs against AD. According to the model presented here, a relatively high flexibility of the enzyme-substrate complex of presenilin and APP-CTF is necessary for the production of short Aβ species. Protein mobility can be constrained e.g. by presenilin FAD mutants or by substrate dimerization. Thus this work contributes to a better understanding of the mechanism of Aβ synthesis. Many different factors can modulate Aβ processing by changing the conformation of the enzyme-substrate complex. This may explain the slow course of AD.