Low Dose Effects of the Brominated Flame Retardant 2,2',4,4',5-Pentabromodiphenyl Ether (PBDE 99) on Rat Development: A Generation Study

Abstract

The production and use of industrial chemicals have increased at an almost exponential rate for the past 50 years, with roughly 10 new chemicals currently being introduced each day. During the same time, a significant rise in the prevalence of developmental human disorders was observed, suggesting that environmental exposure to man-made chemicals is playing an important role in such a trend. Several epidemiological studies support this hypothesis as they found significant correlations between some human disabilities and diseases (e.g. reduced male reproductive health, increases in neurodevelopmental disorders) and environmental contaminants (e.g. DDT, lead, mercury, PCBs). Among them, the risks posed by the flame retardant polybrominated diphenyl ether (PBDE) is of concern as monitoring studies have detected increasing levels of this persistent compound in biota samples over the past decades. PBDEs are largely used in industrialized materials due to their potent flame retardant properties, therefore, they are ubiquitous in the environment. Although little is known about their toxicity, experimental studies in rodents indicate that this class of compounds possesses a wide range of toxicity. Effects on thyroid hormone homeostasis, hepatic metabolizing enzymes and neurobehavior have been demonstrated in laboratory animals. However, there is still scarce information on developmental and reproductive effects of PBDEs claiming for more experimental investigations. The exposure during critical periods of organogenesis and the sensitivity of developmental processes to relatively small changes in endogenous steroid levels suggest that endocrine disruption during development may have long- lasting deleterious effects (organizational effects) which are often permanent In this thesis, several aspects of PBDE 99 toxicity were studied experimentally in rats using doses close to human exposure. Briefly, two experiments were conducted in which pregnant Wistar rats were treated orally by gavage with 60µg or 300µg PBDE 99 / kg body weight on gestation day six. In experiment I, tissue distribution of PBDE 99, effects on thyroid hormonal status and hepatic enzyme activities were evaluated in dams and offspring during lactation. The second experiment was designed to investigate the possible long term effects of PBDE 99 that can become apparent during puberty and adulthood. In order to assess thyroid hormone mediated-effects, an additional reference group for thyroid hormone effects was treated with the goitrogen 6-n-propyl-2-thiouracil (PTU) by placing 5mg of PTU / liter drinking water from GD 7 � 21\. Consistent data are presented here showing that, at least in rats, developmental exposure to low doses PBDE 99 adversely affects offspring health. In experiment I, thyroid hormone (TH) concentrations were measured in dams and offspring along the lactational period. Briefly, thyroid hormone effects were translated into decreases in thyroxin (T4) concentration induced by PBDE 99 affecting dams at the beginning of lactation and offspring at the end of lactation. Additionally, slight changes in hepatic metabolizing enzymes were also observed. Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity was significantly reduced in dams whereas male offspring had increased EROD levels by the end of lactation. Moreover, analyzing the phase II metabolic enzyme uridine diphosphoglucuronosyl transferase (UDPGT), only offspring have been affected by PBDE 99 displaying a slight increase in UDPGT activity on PND 1. Since the thyroid hormone signal is essential for several physiological processes, alteration of TH during critical periods of development may lead to organizational effects compromising offspring health. Furthermore, the fluctuation of hepatic enzyme activities may have biological relevance as the clearance rate and formation of toxic metabolites are unbalanced in exposed animals. Small changes in the metabolic clearance can expose the developing organism to high levels of reactive metabolites and /or the xenobiotic itself. In this thesis, consistent data are presented demonstrating that PBDE 99 is very persistent as significant amounts of the substance were found in rat tissues (liver and adipose tissue) approximately 37 days after the administration. Furthermore, placental transfer of PBDE 99 seems to be very effective as high concentrations of the parent compound were detected in offspring tissue at the first day of life. Due to high levels of PBDE 99 in dams adipose tissue, it is reasonable to assume that milk transfer is an important way of exposure. In experiment II, developmental exposure to low doses of PBDE 99 caused long-lasting behavioral changes in offspring. Using a robust method to assess basal locomotor activity (Mobilitron ®), rat offspring were hyperactive on PND 36 after pre- and postnatal exposure to 300µg PBDE 99 / kg BW. Later at puberty (PND 71), the effect persisted but at this time animals exposed to 60µg PBDE 99 were also hyperactive. The neurobehavioral effects observed in rats in this study support the prerogative that environmental pollutants are playing an important role in the incidence of neurobehavioral disorders in children. Persistent effects on the male reproductive system were also seen in offspring after pre- and postnatal exposure to low doses of PBDE 99. At adulthood, subtle changes in reproductive organ weights were observed followed by significant decreases in sperm and spermatid numbers, as well as daily sperm production. A flow cytometry analysis of germ cells, on the basis of their DNA ploidy/stainability level, confirmed that PBDE 99 affects spermatogenesis in adult male rats. These changes were revealed by an increased number of diploid cells with a concomitant reduction of haploid cells. The effect became clear when the ratio of haploid / diploid cell was plotted. In order to investigate possible mechanisms involved, morphometric analysis of the seminiferous tubules was performed. It seems that decreases in daily sperm production are independent from Sertoli cell number as we did not find any difference in the morphometric analysis. Moreover, at adulthood testosterone and LH levels were within control range, suggesting a minor role of steroid hormones in such a decline. However, we can not rule out the possibility of an early depression of FSH and testosterone in those rats during a critical phase of development which might have affected the spermatogenesis at adulthood. In summary, the main results presented in this study are: \- Tissue distribution data of PBDE 99 indicates that offspring were exposed in utero and during lactation; \- Thyroid hormone homeostasis was altered in dams and offspring exposed to PBDE 99; \- Offspring exposed to PBDE 99 during critical periods of development were hyperactive. This effect persisted at least until puberty; \- Male reproductive health was affected in offspring at adulthood, translated into reduced spermatogenesis. Low dose effects have been demonstrated in several experimental studies. Concerning the risk assessment of environmentally persistent compounds, the question if studies carried out with high doses are sufficient for comprehensive evaluation of risks is controversially discussed. Therefore, there is a need for studies at low dose levels in order to get a complete toxicity profile of a substance. In this context, this thesis presents consistent data demonstrating that low dose exposure to PBDE 99 may lead to a broad range of functional effects in offspring. Moreover, low dose exposure to PBDE 99 during critical periods of development may lead to organizational effects in rats which were translated into impairment of male reproductive health at adulthood. In the point of view of human risk assessment, this is the lowest dose of PBDE 99 reported to date to have an in vivo effect. Another relevant aspect investigated in this study regards the tissue distribution of PBDE 99. The issue of toxicokinetic is extremely important for human risk assessment, but often is not included in developmental and reproductive toxicity studies. In this study, the quantification of PBDE 99 concentrations in rat tissues provides a useful tool for risk assessors due to the possibility of comparing the experimental data with the human exposure situation. In this study, adipose tissue concentration in dams exposed to the lowest dose of PBDE 99 were only 4.2- and 28.6-fold higher than the highest and mean PBDE 99 levels reported in human breast adipose tissue, respectively. This work can contribute to the evaluation of PBDE 99 for human risk assessment. Consistent evidences have shown that at least in rats, environmental levels of PBDE 99 pose risks for the developing organism. Therefore, the results indicate that the subpopulation at risk for adverse effects of environmentally relevant (low dose) exposures to PBDEs is the developing organism.

Die Produktion und Verwendung industrieller Chemikalien ist in den vergangenen 50 Jahren nahezu exponentiell angestiegen. Zur Zeit werden täglich ca. 10 neue Chemikalien auf den Markt gebracht. Während dieser Zeitspanne konnte ein signifikanter Anstieg von Entwicklungsstörungen beim Menschen beobachtet werden, welcher mit der Exposition gegenüber Chemikalien, die in der Umwelt persistieren, in Zusammenhang gebracht wird. Diese Hypothese wird durch Ergebnisse verschiedener epidemiologischer Studien gestützt, in welchen eine signifikante Korrelation zwischen einigen Störungen und Krankheiten beim Menschen (z.B. verminderte Zeugungsfähigkeit beim Mann, Anstieg neurologischer Entwicklungsstörungen bei Kindern) und dem Vorkommen bestimmter Umweltkontaminanten, wie z.B. DDT, Blei, Quecksilber oder PCBs, festgestellt wurde. Das Flammschutzmittel Polybromierter Diphenylether (PBDE) ist eines dieser persistierenden Chemikalien, welches im Laufe der letzten Jahrzehnte in zunehmender Konzentration in biologischen Proben aus der Umwelt gefunden wurde und daher ein Gesundheitsrisiko darstellen kann. PBDE werden auf Grund ihrer hervorragenden feuerabweisenden Eigenschaften in großen Mengen in verschiedenen industriell gefertigten Materialien verwendet und kommen daher ubiquitär in der Umwelt vor. Experimentelle Studien an Nagern darauf hin, dass diese Substanzklasse eine breite Spanne an toxischen Eigenschaften besitzt. So wurden bei Labortieren Effekte auf den Schilddrüsenhormonhaushalt, auf Enzyme des hepatischen Stoffwechsels und auf das Verhalten beschrieben. Es existiert jedoch nur wenig Information über mögliche Effekte auf Reproduktion und prä- oder postnatale Entwicklung. Die Exposition während kritischer Phasen der Organogenese und die Empfindlichkeit des sich entwickelnden Organismus gegenüber geringen Veränderungen des Hormonhaushalts kann zu lang anhaltenden und oft permanenten Effekten führen, die als �organisational effects� bezeichnet werden. In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte zur Toxizität des Kongeners PBDE 99 bei der Ratte untersucht. Hierfür wurden Dosierungen verwendet, die sich im Bereich der Konzentrationen bewegte, denen Menschen in der Umwelt ausgesetzt sind. Es wurden zwei Experimente durchgeführt, in welchen trächtige Wistar Ratten per Schlundsonde an Tag 6 der Trächtigkeit einmalig mit 60 µg und 300 µg PBDE 99/kg Körpergewicht behandelt wurden. In Experiment I wurden die Gewebekonzentrationen von PBDE 99, die Wirkung auf den Schilddrüsenhormonstatus sowie die Aktivitäten bestimmter Leberenzyme bei den Muttertieren und den Nachkommen während der Laktationsperiode untersucht. Ziel von Experiment II war es mögliche Langzeiteffekte, die während der Pubertät und des Erwachsenenalters auftreten können, zu untersuchen. Um mögliche Schilddrüsenhormon-vermittelte Effekte bestimmen zu können, wurde eine zusätzliche Gruppe als Positivkontrolle von Tag 7 bis Tag 21 der Trächtigkeit mit der goitrogenen Substanz 6-n-Propyl-2-Thiouracil (PTU) über das Trinkwasser in einer Konzentration von 5mg/Liter behandelt. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Exposition von sich in der Entwicklung befindenden Rattenfeten gegenüber niedrigen Dosierungen von PBDE 99 zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen der Nachkommen führt. In Experiment I wurden die Schilddrüsenhormonkonzentrationen der Muttertiere und ihrer Nachkommen während der Laktationsperiode gemessen. Es kam bei den Muttertieren zu Anfang der Laktation und bei den Nachkommen zum Ende der Laktation zu einer Verminderung der Konzentration von Thyroxin (T4) im Blut. Zusätzlich zeigten sich leichte Veränderungen der hepatischen Stoffwechselenzyme. Die Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) Aktivität der Muttertiere war signifikant erniedrigt, während die männlichen Nachkommen gegen Ende der Laktation eine Erhöhung der EROD Aktivität aufwiesen. Darüberhinaus zeigten nur die Nachkommen an Tag 1 postnatal (PND) eine leichte Erhöhung des Phase II Enzyms Uridin-diphosphoglucuronosyl-transferase (UDPGT). Schilddrüsenhormone sind unerläßlich bei der Regulierung verschiedener physiologischer Prozesse. Eine Änderung des Schilddrüsenhormonhaushalts während kritischer Phasen in der Entwicklung kann daher zu �organisational� Effekten führen, die die Gesundheit der Nachkommen beeinträchtigen. Hinzu kommt, dass die Veränderungen der Enzymaktivitäten in der Leber zu einer Störung des Gleichgewichts zwischen der Ausscheidungsrate und der Bildung toxischer Metaboliten führen kann. So können kleine Veränderungen der Stoffwechselrate in der Leber den sich in der Entwicklung befindenden Organismus mit hohen Konzentrationen der Substanz und/oder mit ihren toxischen Metaboliten belasten. Der Nachweis signifikanter Konzentrationen an PBDE 99 in Leber und Fettgewebe der Nachkommen noch ca. 37 Tage nach der Behandlung der Muttertiere zeigt, dass dieses Kongener eine hohe Persistenz besitzt. Darüberhinaus zeigte die Untersuchung der toxikokinetischen Eigenschaften von PBDE 99, dass der diaplazentare Übergang vom Muttertier auf die Nachkommen sehr effektiv zu sein scheint, da hohe Konzentrationen der Substanz in Leber und Fettgewebe der Nachkommen bereits am ersten Lebenstag gemessen werden konnten. Im Fettgewebe der Muttertiere wurden ebenfalls hohe Konzentrationen an PBDE nachgewiesen, die den Schluß zulassen, dass eine beachtliche Menge der Substanz über die Muttermilch an die Nachkommen weitergegeben wird. In Experiment II kam es zu langanhaltenden Verhaltensänderungen bei den Nachkommen. Die Tiere zeigten unter Verwendung einer robusten Methode zur Messung der basalen lokomotorischen Aktivität, nach prä- und postnataler (via Muttermilch) Exposition gegenüber 300µg PBDE 99/kg Körpergewicht an PND 36 eine Hyperaktivität, die auch während der Pubertät (PND 71) noch bestehen blieb. In der Gruppe, die gegenüber 60 µg PBDE 99 exponiert war, zeigten die Nachkommen nur während der Pubertät erhöhte Aktivität. Die bei Ratten beobachteten Effekte stützen die These, dass Umweltgifte eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Verhaltensstörungen bei Kindern spielen können. Nach prä- und postnataler Exposition gegenüber PBDE 99 kam es zu persistierenden Effekten auf das Reproduktionssystem der männlichen Nachkommen. Im Erwachsenenalter zeigten sich bei den Tieren leichte Gewichtsveränderungen an den Fortplanzungsorganen, die von einer signifikanten Verringerung der Spermien- und Spermatidenanzahl, sowie der täglichen Spermienproduktion begleitet wurden. Die Durchflußzytometrie der Keimzellen, die auf der Basis der DNA Ploidie/Anfärbbarkeit beruht, zeigte, dass PBDE 99 die Spermatogenese bei der adulten männlichen Ratte beeinträchtigt. Die Anzahl der dipoiden Zellen war erhöht, bei gleichzeitiger Abnahme der haploiden Zellen. Um mögliche Wirkungsmechanismen herauszufinden, wurde eine morphometrische Untersuchung der Samenkanälchen durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die Verringerung der täglichen Spermienproduktion von der Anzahl der Sertolizellen im Hoden unabhängig zu sein scheint, da keine Änderung der Sertolizellzahl festgestellt werden konnte. Sexualhormone scheinen ebenfalls kaum an dem Mechanismus beteiligt zu sein, da die Konzentrationen von Testosteron und Luteinisierendem Hormon (LH) unverändert waren. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass eine frühe Unterdrückung der Konzentration an Testosteron und Follikelstimulierendem Hormon (FSH) während einer kritischen Entwicklungsphase zu der Beeinträchtigung der Spermatogenese geführt haben könnte. Die Ergebnisse der Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: � Die Messungen der Gewebekonzentrationen weisen darauf hin, dass die Nachkommen sowohl im Mutterleib, als auch während der Lakatationsperiode gegenüber PBDE 99 exponiert waren. � Der Schilddrüsenhormonhaushalt war bei den Muttertieren und den Nachkommen nach Exposition gegenüber PBDE 99 verändert. � Die während der Entwicklung exponierten Nachkommen waren hyperaktiv. Dieser Effekt blieb bis zur Pubertät bestehen. � Im Erwachsenenalter zeigte sich bei den männlichen Nachkommen eine Beeinträchtigung des Reproduktionssystems, die durch eine verringerte Spermatogenese deutlich wurde. Effekte nach Exposition gegenüber niedrigen Dosierungen wurden bereits in verschiedenen experimentellen Studien nachgewiesen. Es wird derzeit kontrovers diskutiert, ob eine Risikoabschätzung ausschließlich auf der Basis von hohen Dosierungen möglich ist. Aus diesem Grund sind Studien mit niedrigen Dosierungen und ihre Einbeziehung in die Risikobewertung für den Menschen notwendig. In diesem Zusammenhang zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Behandlung von trächtigen Ratten mit PBDE 99 zu einer Reihe von funktionellen Störungen bei den Nachkommen führt. Darüberhinaus verursacht die Exposition der Nachkommen gegenüber niedrigen Dosierungen während kritischer Entwicklungsphasen �organisational� Effekte, die sich bei den männlichen Tieren in einer Beeinträchtigung des Reproduktionssystems im Erwachsenenalter äußern. Hinsichtlich der Risikoabschätzung für den Menschen, ist dies die niedrigste Dosis, die in einer in vivo Studie Effekte zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Untersuchung ist die Verteilung der Substanz im Gewebe. Toxikokinetische Untersuchungen sind wichtig für die Risikoabschätzung für den Menschen und werden in Studien zur Entwicklungs- und Reproduktionstoxizität einer Substanz häufig nicht miteinbezogen. Die Quantifizierung der Gewebekonzentrationen bei der Ratte nach Gabe von PBDE 99 erleichtert die Risikobewertung durch die Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit der Humanexposition. In dieser Arbeit wurden Effekte in einem Dosisbereich beobachtet, der nur 4,2- bzw. 28,6-fach höher liegt, als die höchsten und mittleren in menschlichem Brustfettgewebe gemessenen Konzentrationen an PBDE 99. Diese Arbeit kann zur Risikobewertung von PBDE 99 für den Menschen beitragen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass PBDE 99 bei der Ratte in Dosierungen, die nahe der Umweltbelastung mit dieser Substanz liegen, für den sich in der Entwicklung befindenden Organismus eine Gefährdung darstellt. Daher können, in Bezug auf den Menschen, ungeborene Kinder als eine Subpopulation angesehen werden, für die die Exposition gegenüber PBDE ein Gesundheitsrisiko darstellt.