Charakterisierung der Expression und Modulation des HVEM-BTLA-Ligand-Rezeptor- Systems

Abstract

Für die Aufrechterhaltung der Balance des Immunsystems sind zahlreiche regulatorische Moleküle von Bedeutung, unter anderem BTLA und HVEM. Die Untersuchung der Expression und der Funktion dieses neuen Rezeptor-Liganden- Paares in vitro und in vivo war das Ziel dieser Arbeit. Um profunde Analysen dieses BTLA-HVEM-Systems zu ermöglichen, wurden zunächst ein BTLA- Fusionsprotein, verschiedene HVEM-Transfektanten sowie eine Vielzahl von HVEM- spezifischen monoklonalen Antikörpern generiert, mit sowohl blockierender als auch nicht-blockierender Wirkung auf die BTLA-HVEM-Bindung. Diese Antikörper ermöglichten erstmals eine umfassende Analyse der Expression von HVEM auf Proteinebene in der Immunhistochemie und der Durchflusszytometrie. Eine prominente Expression von HVEM konnte in den lymphatischen Organen, jedoch insbesondere in den immunologisch relevanten peripheren Organen Lunge und Darm nachgewiesen werden. Die Untersuchung von HVEM und BTLA im Ruhezustand ergab, dass beide Moleküle konstitutiv entweder auf hohem oder niedrigem Niveau von allen untersuchten Populationen der Leukozyten exprimiert werden. Eine außergewöhnliche Beobachtung stellte die inverse Expression der beiden Moleküle dar. Durch die Verwendung transfizierter Zelllinien sowie genetisch veränderter Mäuse gelang es in vitro und in vivo die gegenseitige Abhängigkeit der HVEM- und BTLA-Expression eindeutig nachzuweisen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der Zell-Zell-Kontakt dabei von wesentlicher Bedeutung für die gegenseitige Modulation ist. Diese initialen Resultate stellen die Grundlage für die weiterführende detaillierte Klärung des Modulationsmechanismus dar. Auch im Verlauf der T Zell-Aktivierung wird die Expression von HVEM und BTLA in vitro und in vivo entgegengesetzt reguliert. In vitro Versuche mit genetisch veränderten Mäusen zeigten, dass im Gegensatz zum Ruhezustand die Regulation im Verlauf der Aktivierung nur bedingt von der Interaktion beider Moleküle, sondern überwiegend durch das T Zell-inhärente Aktivierungsprogramm, bestimmt wird. Die konstitutive Expression und die gegenseitige Modulation von HVEM und BTLA bietet dem Immunsystem somit die Möglichkeit über verschiedenste Regulationswege flexibel auf äußere Einflüsse zu reagieren und die Immunantwort unter anderem über die dämpfende Wirkung von BTLA zu regulieren.

Several molecules like BTLA and HVEM play a prominent role in balancing the activation status of the immune system. The aim of the current work was to study the expression and function of this new receptor-ligand pair in vitro and in vivo. As a prerequisite for a comprehensive analysis of the HVEM-BTLA system various tools, among them a BTLA-fusion protein, different HVEM- transfectants, and a collection of monoclonal antibodies, with either blocking or non-blocking effect on BTLA-HVEM interaction, were generated. For the first time, an extensive analysis of the HVEM expression on protein level using immunohistochemistry and flow cytometry was achieved with these antibodies. A strong expression of HVEM was found in lymphoid organs and especially in the lungs and gut, two immunologically relevant peripheral organs. Further examination of HVEM and BTLA in the resting state revealed a constitutive expression of both molecules on either high or low level on all leukocyte populations analyzed. Unexpectedly, these molecules were expressed in a reversed fashion in all instances. The interdependence of HVEM and BTLA expression was demonstrated in vitro and in vivo by several experimental setups using transfected cell lines as well as genetically modified mice. It became evident in this context that cell-cell contact plays an essential role in the reciprocal modulation of HVEM and BTLA. These initial results provided the basis for further detailed analyses to clarify the mechanism of modulation. The reverse regulation of HVEM and BTLA expression was also observed during T cell activation in vitro and in vivo. In vitro experiments using genetically modified mice revealed, that differing from the resting state, the regulation in the course of activation is not exclusively determined by the interaction of the two molecules, but is mainly influenced by the inherent T cell activation programme. The constitutive expression and the interdependent modulation of HVEM and BTLA thus enable the immune system to react flexibly to environmental influences via a variety of regulatory pathways. This regulatory circle allows, among others, to modify the immune response through the suppressive action of BTLA.