Ferroportin 1 expression regulates intracellular growth of Salmonella enterica serovar Typhimurium, a link between innate immunity and hereditary hemochromatosis

Abstract

Hemochromatosis type 4 is an iron overload disease which is caused by mutations of ferroportin 1 (FPN1), the only known eukaryotic iron-exporter to date. FPN1 is a transmembrane protein that is post-transcriptionally regulated by hepcidin. Treatment of cells with hepcidin results in internalization and degradation of cell surface FPN1. The Q182H mutant of FPN1 appears to be unresponsive to hepcidin and does not show the expected internalization on exposure to hepcidin. Hepcidin is upregulated in response to iron overload, inflammation and infection. Salmonella enterica serovar Typhimurium, the causative agent of gastroenteritis in humans, produces a severe systemic disease resembling human typhoid fever in mice. In typhoid, pathogens survive for extended periods of time in a host cell compartment, the Salmonella- containing vacuole, which is segregated from the normal late endosomal trafficking pathway. Salmonella require iron as a nutrient for survival and for maintaining full virulence. Correspondingly, the mammalian metal transporter Nramp1 functions in innate defense against the organism by altering intracellular iron concentrations. I carried out experiments to test the idea that FPN1, another macrophage iron transporter, might also be involved in regulating the intracellular growth of Salmonella. Moreover, I tested the idea that the Q182H mutant may differently affect Salmonella s growth than wild-type FPN1. In this study, I used transiently transfected HeLa cells and stably transfected J774 macrophages to evaluate the effect of FPN1 and hepcidin on intracellular growth of Salmonella enterica serover Typhimurium. Viable intracellular bacteria were quantified by gentamicin protection assays at 2 and 22 h post-infection. I found that increased expression of FPN1, either in transiently transfected HeLa cells or in stably transfected J774 macrophages, resulted in significant inhibition of bacterial growth. Conversely, when I treated FPN1 expressing cells with hepcidin, intracellular growth of Salmonella was enhanced. This effect was less pronounced with the hepcidin-resistant mutant Q182H of FPN1. My findings indicate an important role for FPN1 in controlling the growth of Salmonella inside cells and suggest that altered FPN1 expression and function in hemochromatosis, and possibly other iron overload states, may explain the susceptibility to intracellular pathogens in these conditions. While upregulation of hepcidin in response to infection is generally considered to be protective, my observations indicate that the opposite is true for intracellular pathogens. Hepcidin-resistant FPN1 mutations like Q182H may thus confer an advantage to the infected host by preserving resistance to intracellular pathogens even in the presence of elevated hepcidin. My data provide the first molecular evidence for a possible mechanism that can explain why the mutant variant Q182H of FPN1 persisted during evolution.

Hämochromatose Typ 4 ist eine durch Eisenüberladung gekennzeichnete Eisenstoffwechselstörung, die durch Mutationen in Ferroportin 1 (FPN1) verursacht wird, welches das einzige zur Zeit bekannte Eisenexportprotein ist. FPN1 ist ein Transmembranprotein, dessen Expression an der Zelloberfläche posttranskriptionell von Hepzidin reguliert wird. Werden Zellen mit Hepzidin behandelt, wird FPN1 vermindert an der Zelloberfläche exprimiert, internalisiert und lysosomal degradiert. Die Q182H Mutante des FPN1 scheint nicht auf Hepzidin zu reagieren, denn die erwartete verminderte Expression von FPN1 an der Zelloberfläche nach Kontakt mit Hepzidin erfolgt nicht. Hepzidin ist ein Peptid, das in Folge von Eisenüberladung, Entzündung oder Infektion von der Leber sezerniert wird. Salmonella enterica serovar Typhimurium verursacht Gastroenteritis im Menschen und eine schwere systemische Erkrankung in der Maus, die dem menschlichen Typhus ähnlich ist. Bei Typhus überlebt das Bakterium intrazellulär für einen längeren Zeitraum in einer Vakuole, die vom späten endosomalen Stoffwechsel getrennt ist. Salmonellen brauchen Eisen sowohl zum Überleben als auch um ihre Virulenz vollständig aufrechtzuerhalten. Der Eisentransporter Nramp1 ist Teil der angeborenen Abwehr gegen Organismen, indem er die intrazelluläre Eisenkonzentration verändert. In der vorliegenden Dissertationsschrift habe ich untersucht, ob FPN1, ein anderer Eisentransporter des Monozyten-Makrophagen-Systems, ebenfalls eine Rolle bei der Regulation des intrazellulären Wachstums von Salmonellen spielt. Ausserdem habe ich untersucht, ob die Q182H Mutante anders als natives FPN1 Salmonellen reguliert. In dieser Arbeit benutze ich transient transfizierte HeLa Zellen und stabil transfizierte J774 Makrophagen, um den Effekt von FPN1 und Hepzidin auf das intrazelluläre Wachstum von Salmonella enterica serovar Typhimurium zu evaluieren. Lebende intrazelluläre Bakterien wurden 2 und 22 Stunden nach der Infektion quantifiziert. Meine Ergebnisse von Gentamizin-Protektions-Assays zeigen, dass vermehrte Expression von Ferroportin das intrazelluläre Wachstum von Salmonellen vermindert. Dieser Effekt wird durch Hepzidin revidiert. Die Q182H Mutante des FPN1 ist resistent gegenüber Hepzidin und mindert Hepzidin s fördernden Effekt auf das bakterielle Wachstum. Meine Ergebnisse weisen eine wichtige Rolle von FPN1 in der Abwehr gegen intrazelluläre Salmonellen auf und lassen vermuten, dass Änderungen in der FPN1 Expression and Funktion, wie es bei der Hämochromatose und anderen durch Eisenüberladung gekennzeichneten Krankheiten der Fall ist, die Anfälligkeit für intrazelluläre Bakterien erklären. Während Hochregulation von Hepzidin bei Infektion allgemein als Schutz angesehen wird, lassen meine Beobachtungen vermuten, dass das Gegenteil bei intrazellulären Infektionen zutrifft. Hepzidin-resistente FPN1 Mutationen wie z.B. Q182H können zum Vorteil für den infizierten Wirt sein, indem sie Resistenz sogar bei vermehrtem Hepzidin gegen intrazelluläre Bakterien vermitteln. Das ist der erste Nachweis auf molekularer Ebene, der erklären kann, warum die Q182H Mutation von FPN1 während der Evolution persistiert hat.