Antimicrobial peptides: pharmacodynamics, combinatorial effects and resistance evolution

Abstract

Antimicrobial peptides (AMPs) are ancient and conserved across the tree of life. They are the most important components in immune system due to their distinct mechanisms of killing bacteria. In this thesis, a pharmacodynamic approach was taken to investigate why bacteria are less likely to develop resistance to the nature immune system, especially to one of its components AMPs. In this thesis, the combination effects of AMPs were firstly investigated. Six different AMPs from different organisms were selected to test their individual and combined effects in vitro. With an approach based on pharmacodynamics and Loewe additivity, the interactions of AMPs were found mostly synergistic. Three-AMP combinations displayed stronger synergism than two-AMP combinations. Additionally, AMPs displayed a sharp increase in killing within a narrow dose range contrasting with those of antibiotics. Followed by a theoretical study, the combination effect between AMPs was explored using mathematical model that captures the dynamics of attachment and detachment between AMPs and cell membrane. In this multi-hit model, bacteria are killed when a certain number of targets are hit by antimicrobials. This bottom-up approach revealed that Bliss independence should be the model of choice if no interaction between antimicrobial molecules is expected; Loewe additivity, on the other hand, describes scenarios in which antimicrobials affect the same components of the cell, i.e. are not acting independently. The choice of the additivity term is essential to determine synergy or antagonism of antimicrobials. The AMPs were found fundamentally different from antibiotics in their pharmacodynamic characteristics. This difference was further implemented within a theoretical framework to predict the evolution of resistance. The comparative analysis of resistance evolution demonstrated that pharmacodynamic differences all combine to produce a much lower probability that resistance will evolve against antimicrobial peptides. The finding can be generalized to all drugs with pharmacodynamics similar to AMPs. Pharmacodynamic concepts are familiar to most practitioners of medical microbiology, and data can be easily obtained for any drug or drug combination. The theoretical and conceptual framework is therefore widely applicable and can help avoid resistance evolution if implemented in antibiotic stewardship schemes or the rational choice of new drug candidates. Next, A model multiple-step mutations which can describe more complicated situation was used to simulate the resistance evolution in the treatment of antimicrobials. In this model, each mutant was captured by a set of pharmacodynamics. By monitoring the time of resistance emergence, simulations showed that mutants with medium increment of MIC will emerge earlier. Mutation with fitness cost will slow down the resistance evolution. The fitness cost in resistant mutants is likely to be compensated as lately as possible, otherwise will hinder the emergence of later fitter mutant and thus slows down the resistance evolution. For a given mutants, the shape of dose-response and maximal killing rate that can be achieved by antimicrobials nearly have no influence on the time of their emergence. Because of the emergence and selection of fitter mutant always happens in the subMIC of this mutant. It also showed that treatment strategy and pharmacokinetics do not affect the rage of concentration that select resistance. Taken together, the thesis highlights that pharmacodynamic parameters of antimicrobials plays a decisive role in resistance selection. This can be applied in screening for resistance- proof drugs. In addition, it also explains the evolution of innate immune system which usually produces a mixture of AMPs to fight against infections. For example, mixtures of AMPs show strong synergism and steeper dose response curves in their pharmacodynamics.

Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind ein ursprüngliches Merkmal, welches im Stammbaum des Lebens konserviert ist. Aufgrund ihrer besonderen Mechanismen, mit denen sie Bakterien abtöten, sind sie die wichtigsten Komponenten im Immunsystem. In dieser Arbeit wurde mit einem pharmakodynamischen Ansatz untersucht, warum Bakterien mit geringerer Wahrscheinlichkeit Resistenzen gegen das angeborene Immunsystem, insbesondere gegen AMPs, entwickeln. Zuerst wurde der Effekt der Kombination von AMPs getestet. Sechs verschiedene AMPs von verschiedenen Organismen wurden auserwählt um ihre individuellen und kombinatorischen Auswirkungen in vitro zu ermitteln. Mit einem Ansatz, welcher auf Pharmakodynamik und der Loewe Additivität basiert, zeigten sich größtenteils synergistische Interaktionen der AMPs. Kombinationen von drei AMPs zeigten stärkere Synergien als solche mit nur zwei Komponenten. Weiterhin wurde, im Gegensatz zu Antibiotika, ein deutlicher Anstieg im Abtöten von Bakterien innerhalb eines engen Dosierungsbereichs beobachtet. Im Folgenden wurde theoretisch der kombinatorische Effekt von AMPs mit einem mathematischen Modell untersucht, welches die Dynamiken von Bindung und Ablösen zwischen AMPs und Zellmembran berücksichtigt. In diesem Modell werden Bakterien als getötet betrachtet, wenn eine bestimmte Anzahl von Zielen von antimikrobiellen Peptiden angegriffen wurde. Dieser Bottom-up Ansatz zeigte, dass die Unabhängigkeit nach Bliss als Modell verwendet werden sollte, wenn keine Interaktion zwischen den antimikrobiellen Molekülen zu erwarten ist. Die Loewe Additivität hingegen beschreibt Szenarien in denen die AMPs dieselben Komponenten der Zelle angreifen und demnach nicht unabhängig voneinander agieren. Die Auswahl der additiven Bedingungen im Modell ist essentiell um Synergien oder Antagonismen von antimikrobiellen Peptiden zu bestimmen. Die phamakodynamischen Merkmale der AMPs erwiesen sich als fundamental unterschiedlich gegenüber denen von Antibiotika. Dieser Unterschied wurde weiterhin in einem theoretischen Rahmen zur Vorhersage der Evolution von Resistenzen angewendet. Die vergleichende Analyse der Resistenzevolution machte deutlich, dass die kombinierten pharmakodynamische Eigenschaften für eine geringere Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Resistenzen gegenüber AMPs sorgen. Das Ergebnis kann hinsichtlich aller Wirkstoffe mit ähnlichen Pharmakodynamiken wie AMPs verallgemeinert werden. Pharmakodynamische Konzepte sind den meisten Fachleuten in der medizinischen Mikrobiologie bekannt und Daten können einfach sowohl für beliebige einzelne, als auch für Kombinationen von Wirkstoffen ermittelt werden. Das theoretische Konzept ist demnach im breiten Rahmen anwendbar und kann helfen, Evolution von Resistenzen zu vermeiden, wenn es in Verwaltung von Antibiotika oder der Auswahl neuer potentieller Wirkstoffe berücksichtigt wird. Darüber hinaus wurde ein Modell mit mehrstufigen Mutationen verwendet, welches kompliziertere Situationen hinsichtlich der Resistenzevolution bei der Behandlung mit antimikrobiellen Peptiden simulieren kann. In diesem Modell wurde jeder Mutant mit einer Auswahl von Pharmakodynamiken erfasst. Indem der Zeitraum in dem sich Resistenzen entwickelt hatten, ermittelt wurde zeigten Simulationen dass Mutanten mit einem mittleren Zuwachs in der MIC früher hervortraten. Mutationen mit Fitnesskosten verlangsamen die Resistenzevolution. Die Fitnesskosten in resistenten Mutanten werden höchstwahrscheinlich so spät wie möglich kompensiert, da sie ansonsten das Auftreten der späteren, fitteren Mutanten verhindern und die Evolution von Resistenzen verlangsamen würden. Für gegebene Mutanten haben die Reaktionen auf die Dosierung und die maximale Tötungsrate, welche mit antimikrobiellen Peptiden erreicht werden können, fast keinen Einfluss auf den Zeitpunkt ihres Auftretens. Dies kann dadurch erklärt werden, dass das Auftreten und die Selektion von fitteren Mutanten immer in im subMIC-Bereich des jeweiligen Mutanten passiert. Auch wurde verdeutlicht, dass Behandlungsstrategie und Pharmakokinetik keinen Einfluss auf das Konzentrationsspektrum, in dem auf Resistenzen selektiert wird, haben. Zusammengenommen betont die vorliegende Arbeit, dass pharmakodynamische Parameter von antimikrobiellen Peptiden eine entschiedene Rolle in der Selektion von Resistenzen spielen. Die Ergebnisse können in der Auswahl von resistenzsicheren Wirkstoffen Anwendung finden. Weiterhin liefern sie Erklärungen für die Evolution von angeborenen Immunsystemen, welche normalerweise einen Mix an AMPs im Kampf gegen Infektionen produzieren. Beispielsweise zeigen Mixe von AMPs starke Synergien und steilere Dosis- Reaktions-Kurven in ihrer Pharmakodynamik.