Functional expression of temperature-sensitive transient receptor potential channels (TRPs) in cultured human corneal and conjunctival cells: Relevance in the pathophysiology of ocular surface diseases

Abstract

The dry eye syndrome is the prevalent eye disease, which regularly occur in eye clinic practice. It is a field of increasing complexity and several new treatment agents are developed and tested in corneal cell culture models as well as in cornea constructs in recent years. At this point, an increased tear film osmolarity plays an important role in connection with (generally subclinical) inflammation of the ocular surface and the tear film in this disease. Therefore, protective drugs or modulation of putative osmosensitive receptors may help to prevent (theoretically) an increased tear film osmolarity from injuring the ocular surface. Other ocular surface diseases, which are more or less insidious, are corneal (e.g. stromal) dystrophies. Corneal transplantations, mainly penetrating keratoplasty or DMEK, are frequently performed to treat extensive corneal dystrophies. In this connection, the human corneal endothelium plays a major role, since its various functions are crucial for corneal performance. Characteristics and pathophysiological properties of cells in the cornea and conjunctiva are determined by calcium-dependent cellular mechanisms that mediate regulation of intracellular calcium levels. Maintenance of intracellular Ca2+ levels at orders of magnitude below those in the extracellular environment is required for cell viability. TRPs contribute to such control of Ca2+ through modulating their time dependent opening and closing behavior. Such regulation is required for Ca2+ to serve as a second messenger for mediating receptor control of numerous life sustaining responses. In this context, intracellular calcium is significantly regulated by TRPs. As there is an association between aberrant TRP channel expression and human diseases, these regulators of Ca2+ influx in connection with any endogenous modulators may be potential drug targets in a clinical setting. Based on the results of this habilitation thesis, performed experiments and various literature investigations, there are the following insights: 1\. Functional expression of TRPV1 and TRPM8 could be demonstrated in human corneal and human conjunctival cells using highly sensitive functional assays, such as fluorescence calcium imaging and planar patch- clamping. Typical characteristics of these TRPs could be confirmed. Specific investigations were carried out to elucidate further characteristics and pharmacological aspects. 2\. TRPV1 and TRPM8 trigger down-stream signaling. Specifically, TRP channel activation is connected with GPCRs (GPCRs-TRP channel axis). Two different Ca2+ signal transduction pathways, which are activated by thyronamines (T1AM) could be suggested. First, T1AM is activating a GPCR, thereby increasing intracellular Ca2+ via TRPV1. At this point, (beta)-adrenergic receptors were suggested to be involved, since pilot experiments indicated that a corresponding receptor blocker suppressed Ca2+ influx. Second, an interplay between TRPV1 and TRPM8 was suggested, which led to a suppression of Ca2+ influx. 3\. Based on own data and data from collaborations, several possible roles of TRPs could be suggested. First, TRPV1 triggers release of inflammatory mediators as well as mediators for corneal epithelial cell proliferation. Specifically, TRPV1-induced activation increases intracellular Ca2+, which is linked to an increase in IL-6 release. Second, TRPV1 and TRPV4 are osmosensitive channels in ocular cells. Selective drug modulation of either TRPV1/TRPV4 activity or its signaling mediators may yield a novel approach to suppressing inflammatory responses. Finally, a possible role of TRPV1 and TRPM8 in cornea banking was suggested. Donor cornea storage below room temperature (hypothermic corneal preservation) sustains TRPM8 function. In addition, temperature sensitivity can alternatively be used for channel identification in corneal endothelium, because known TRPM8 modulators have a limited selectivity. Furthermore, it was suggested that TRPV1 is very likely involved when corneal endothelial cells are exposed to temperatures above 43 °C, e.g. during transport of the cornea from the cornea bank to the ophthalmic surgeon, because higher temperatures damaged the endothelial cell layer. 4\. Due to the aforementioned acquisition of results, a TRP-channel relevance to ocular function could be suggested: With regard to dry eye syndrome, an inhibitory effect of the osmoprotectant L-carnitine on hypertonicity-induced cell volume shrinkage in the presence of functional TRPV1 expression was demonstrated. This suggests a link between L-carnitine and TRPV1 since hypertonicity also activates TRPV1. 5\. Another option to suppress inflammation (and also pain) in dry eye syndrome is based on results with the aforementioned thyronamine (T1AM). Specifically, T1AM may be as a possible TRPM8-specific ligand, because it activated TRPM8 in HCjEC. Moreover, pre-treatment of these cells with T1AM suppressed a TRPV1-induced Ca2+ influx and suppressed IL-6 linked inflammatory processes. 6\. Finally, future directions and limitations of these studies were discussed. Concerning TRPM8 characteristics, it was demonstrated that electrophysiological data obtained from the HCEC-12 cell line could also be confirmed using normal HCEnC (primary culture). Furthermore, first electrophysiological data in connection with a recently initiated collaboration regarding the development of in vitro human corneal models (cornea construct) confirmed TRPM8 channel expression for the first time in a SV40 immortalized human corneal epithelial model (HCE-T).

Das trockene Auge ist eine prävalente Augenerkrankung in der täglichen klinisch-ophthalmologischen Praxis. In den letzten Jahren wurden mehrere neue Behandlungsstrategien in diesem zunehmend komplexen Feld entwickelt und in Hornhautzellkulturmodellen und Hornhautkonstrukten getestet. Bei dieser Erkrankung spielt die erhöhte Osmolarität in Verbindung mit (subklinischer) Inflammation der Augenoberfläche und des Tränenfilms eine wichtige Rolle. Daher könnten präventive Agenzien oder die Modulation von mutmaßlich osmosensitiven Rezeptoren helfen um erhöhte Tränenfilmosmolarität bei geschädigter Augenoberfläche zu vermeiden. Weitere Erkrankungen der Augenoberfläche, die mehr oder weniger schleichend sind, sind Hornhaut- und Stromadystrophien. Bei extensiven Hornhautdystrophien werden häufig Hornhauttransplantationen (hauptsächlich perforierende Keratoplastik oder DMEK) durchgeführt. In diesem Zusammenhang ist das humane Hornhautendothel ein wichtiger Faktor da dessen Funktionen für die Transparenz der Hornhaut von eminenter Bedeutung sind. Die pathophysiologische Eigenschaften von Horn- und Bindehautzellen sind von Calcium-abhängigen zellulären Mechanismen abhängig welche das intrazelluläre Calcium regulieren. Für die Funktion (und das Überleben) der Zelle ist die Aufrechterhaltung eines extrem niedrigen Calciumniveaus (10000-fach niedriger als die extrazelluläre Calciumkonzentration) entscheidend. Hier tragen überwiegend Calciumkanäle wie z.B. Transient Rezeptor Potenzial (TRP) Kanäle zur Calciumregulation bei. Für die Steuerung zahlreicher (lebenserhaltender) Zellprozesse und Rezeptoren sind Ca2+ Ionen als sekundäre Botenstoffe sehr wichtig. Die intrazelluläre Konzentration dieser Ca2+ Ionen wird im Wesentlichen über die TRP-Kanäle reguliert. Zahlreiche Erkrankungen assoziieren mit einer anomalen TRP- Kanalexpression. Daher könnten diese Regulatoren des Ca2+ Einflusses in Verbindung mit endogenen Modulatoren potenzielle Targets für Entwicklung von Therapien in der Klinik sein. Die Ergebnisse der in der vorliegenden Habilitationsschrift durchgeführten Experimente und Literaturrecherchen sollen im Folgenden aufgeführt werden: 1\. Unter Verwendung von hochsensitiven funktionellen Methoden wie Fluoreszenz Calcium Imaging und planarer Patch- Clamp Technik konnten (erstmals) die funktionelle Expression von TRP-Kanälen wie dem TRPV1 und TRPM8 in humanen Hornhaut- und Bindehautepithelzellen nachgewiesen werden. Es konnten typische charakteristische Eigenschaften dieser TRP-Kanäle bestätigt werden. Um weitere Charakteristiken und pharmakologische Eigenschaften zu validieren wurden weitläufige spezielle Untersuchungen durchgeführt. 2\. TRPV1 und TRPM8 steuern Prozesse, die von der Zellmembran in Richtung Zellkern verlaufen. Die Aktivierung der TRP-Kanäle ist mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) verbunden (GPCR-TRP-Kanal Achse). Hierbei deuteten sich zwei verschiedene Ca2+ Signalwege an, die über die Anwendung von sog. Thyronaminen (3-T1AM) ausgelöst wurden. Zum einen bindet das 3-T1AM an einem Rezeptor (GPCR) und aktiviert TRPV1 Kanäle, die wiederum die intrazelluläre Ca2+ Konzentration erhöhen. Pilotstudien zeigten, dass hier -Adrenorezeptoren involviert sind, da ein spezifischer Blocker dieser Rezeptoren den Ca2+ Anstieg unterdrückte. Zum anderen deutete sich ein Zusammenspiel zwischen TRPV1 und TRPM8 an, welches letztendlich zu einer Unterdrückung des Ca2+ Einflusses führte. 3\. Eigene Daten und Daten aus Kollaborationen weisen auf diverse mögliche Rollen der TRP-Kanäle hin. Zum einen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von TRPV1 inflammatorische Zytokine (Interleukine) und Mediatoren für die Proliferation von Hornhautepithezellen freisetzt. Hierbei erhöht die Aktivierung von TRPV1 das intrazelluläre Ca2+, welches wiederum mit der Freisetzung von IL-6 im Speziellen verbunden ist. Zum anderen konnten osmosensitive Eigenschaften von TRPV1 und TRPV4 in Augenzellen nachgewiesen werden. Selektive Modulation entweder der TRPV1/TRPV4 Kanäle oder dessen Signalvermittler stellen daher neuartige Targets für die Unterdrückung von Inflammation dar. Eine weitere wichtige Rolle von TRPV1 und TRPM8 deutete sich im Zusammenhang mit Hornhautbanken an. Die Lagerung von Hornhäuten unter normaler Raumtemperatur (kühle Hornhautlagerung) erhöht die Funktion von TRPM8. Außerdem kann die spezielle Temperatursensitivität für die Identifikation thermosensitiver TRP- Kanäle im humanen Hornhautendothel genutzt werden, da einige TRPM8 Modulatoren pharmakologisch nicht hoch-spezifisch wirken. Überdies weisen die Daten auch auf eine Involvierung von TRPV1 im Hornhautendothel hin wenn es Temperaturen über 43 °C während des Transports von der Hornhautbank zum Ophthalmochirurgen ausgesetzt ist, wobei eine hohe Temperatur die Hornhautendothelzellschicht beschädigen kann. 4\. Die zuvor genannten Ergebnisse legen wichtige Funktionen der TRP-Kanäle für die Funktion des gesamten Vorderabschnitts des Auges nahe. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Osmoprotektiva mit kompatiblen Soluten wie z.B. das L-Carnitin inhibitorisch auf die TRPV1 Kanalaktivität wirken wenn die Zellen über Hyperosmolarität zum Schrumpfen gebracht wurden. Dies weist auf eine Assoziation zwischen L-Carnitin und TRPV1 hin, da TRPV1 über Hyperosmolarität in Hornhautepithelzellen aktiviert werden kann. 5\. Eine weitere Möglichkeit Inflammation (und auch Schmerz) beim trockenen Auge zu unterdrücken basiert auf die zuvor genannten Befunde mit Thyronaminen (3-T1AM). Hierbei könnte 3-T1AM ein TRPM8-spezifischer Ligand sein, da 3-T1AM spezifisch TRPM8 Kanäle in Hornhautepithel- und Bindehautepithelzellen aktiviert. Überdies führte eine Vorbehandlung dieser Zellen mit 3-T1AM dazu, dass nicht nur der TRPV1-induzierte Ca2+ Anstieg unterdrückt werden konnte. Auch die Freisetzung von Interleukin-6 und damit verbundene inflammatorische Prozesse konnten unterdrückt werden. 6\. Schließlich wurden auch die zukünftige Ausrichtung und Limitationen dieser Studien diskutiert. Ein wichtiger Befund war, dass die TRPM8 Expression nicht nur im HCEC-12 Zellmodell gezeigt werden konnte, sondern auch in Hornhautendothelprimärzellkulturen (HCEnC). Darüber hinaus zeigten erste elektrophysiologische Daten, dass die Expression des TRPM8 erstmals auch in SV40 immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen (HCE-T) bestätigt werden konnte, die in einem in vitro humanen Hornhautmodell (Hornhautkonstrukt) verwendet werden.