dc.contributor.author
Mergler, Stefan
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:44:05Z
dc.date.available
2015-11-06T08:21:56.676Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13792
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17990
dc.description.abstract
The dry eye syndrome is the prevalent eye disease, which regularly occur in
eye clinic practice. It is a field of increasing complexity and several new
treatment agents are developed and tested in corneal cell culture models as
well as in cornea constructs in recent years. At this point, an increased tear
film osmolarity plays an important role in connection with (generally
subclinical) inflammation of the ocular surface and the tear film in this
disease. Therefore, protective drugs or modulation of putative osmosensitive
receptors may help to prevent (theoretically) an increased tear film
osmolarity from injuring the ocular surface. Other ocular surface diseases,
which are more or less insidious, are corneal (e.g. stromal) dystrophies.
Corneal transplantations, mainly penetrating keratoplasty or DMEK, are
frequently performed to treat extensive corneal dystrophies. In this
connection, the human corneal endothelium plays a major role, since its
various functions are crucial for corneal performance. Characteristics and
pathophysiological properties of cells in the cornea and conjunctiva are
determined by calcium-dependent cellular mechanisms that mediate regulation of
intracellular calcium levels. Maintenance of intracellular Ca2+ levels at
orders of magnitude below those in the extracellular environment is required
for cell viability. TRPs contribute to such control of Ca2+ through modulating
their time dependent opening and closing behavior. Such regulation is required
for Ca2+ to serve as a second messenger for mediating receptor control of
numerous life sustaining responses. In this context, intracellular calcium is
significantly regulated by TRPs. As there is an association between aberrant
TRP channel expression and human diseases, these regulators of Ca2+ influx in
connection with any endogenous modulators may be potential drug targets in a
clinical setting. Based on the results of this habilitation thesis, performed
experiments and various literature investigations, there are the following
insights: 1\. Functional expression of TRPV1 and TRPM8 could be demonstrated
in human corneal and human conjunctival cells using highly sensitive
functional assays, such as fluorescence calcium imaging and planar patch-
clamping. Typical characteristics of these TRPs could be confirmed. Specific
investigations were carried out to elucidate further characteristics and
pharmacological aspects. 2\. TRPV1 and TRPM8 trigger down-stream signaling.
Specifically, TRP channel activation is connected with GPCRs (GPCRs-TRP
channel axis). Two different Ca2+ signal transduction pathways, which are
activated by thyronamines (T1AM) could be suggested. First, T1AM is activating
a GPCR, thereby increasing intracellular Ca2+ via TRPV1. At this point,
(beta)-adrenergic receptors were suggested to be involved, since pilot
experiments indicated that a corresponding receptor blocker suppressed Ca2+
influx. Second, an interplay between TRPV1 and TRPM8 was suggested, which led
to a suppression of Ca2+ influx. 3\. Based on own data and data from
collaborations, several possible roles of TRPs could be suggested. First,
TRPV1 triggers release of inflammatory mediators as well as mediators for
corneal epithelial cell proliferation. Specifically, TRPV1-induced activation
increases intracellular Ca2+, which is linked to an increase in IL-6 release.
Second, TRPV1 and TRPV4 are osmosensitive channels in ocular cells. Selective
drug modulation of either TRPV1/TRPV4 activity or its signaling mediators may
yield a novel approach to suppressing inflammatory responses. Finally, a
possible role of TRPV1 and TRPM8 in cornea banking was suggested. Donor cornea
storage below room temperature (hypothermic corneal preservation) sustains
TRPM8 function. In addition, temperature sensitivity can alternatively be used
for channel identification in corneal endothelium, because known TRPM8
modulators have a limited selectivity. Furthermore, it was suggested that
TRPV1 is very likely involved when corneal endothelial cells are exposed to
temperatures above 43 °C, e.g. during transport of the cornea from the cornea
bank to the ophthalmic surgeon, because higher temperatures damaged the
endothelial cell layer. 4\. Due to the aforementioned acquisition of results,
a TRP-channel relevance to ocular function could be suggested: With regard to
dry eye syndrome, an inhibitory effect of the osmoprotectant L-carnitine on
hypertonicity-induced cell volume shrinkage in the presence of functional
TRPV1 expression was demonstrated. This suggests a link between L-carnitine
and TRPV1 since hypertonicity also activates TRPV1. 5\. Another option to
suppress inflammation (and also pain) in dry eye syndrome is based on results
with the aforementioned thyronamine (T1AM). Specifically, T1AM may be as a
possible TRPM8-specific ligand, because it activated TRPM8 in HCjEC. Moreover,
pre-treatment of these cells with T1AM suppressed a TRPV1-induced Ca2+ influx
and suppressed IL-6 linked inflammatory processes. 6\. Finally, future
directions and limitations of these studies were discussed. Concerning TRPM8
characteristics, it was demonstrated that electrophysiological data obtained
from the HCEC-12 cell line could also be confirmed using normal HCEnC (primary
culture). Furthermore, first electrophysiological data in connection with a
recently initiated collaboration regarding the development of in vitro human
corneal models (cornea construct) confirmed TRPM8 channel expression for the
first time in a SV40 immortalized human corneal epithelial model (HCE-T).
de
dc.description.abstract
Das trockene Auge ist eine prävalente Augenerkrankung in der täglichen
klinisch-ophthalmologischen Praxis. In den letzten Jahren wurden mehrere neue
Behandlungsstrategien in diesem zunehmend komplexen Feld entwickelt und in
Hornhautzellkulturmodellen und Hornhautkonstrukten getestet. Bei dieser
Erkrankung spielt die erhöhte Osmolarität in Verbindung mit (subklinischer)
Inflammation der Augenoberfläche und des Tränenfilms eine wichtige Rolle.
Daher könnten präventive Agenzien oder die Modulation von mutmaßlich
osmosensitiven Rezeptoren helfen um erhöhte Tränenfilmosmolarität bei
geschädigter Augenoberfläche zu vermeiden. Weitere Erkrankungen der
Augenoberfläche, die mehr oder weniger schleichend sind, sind Hornhaut- und
Stromadystrophien. Bei extensiven Hornhautdystrophien werden häufig
Hornhauttransplantationen (hauptsächlich perforierende Keratoplastik oder
DMEK) durchgeführt. In diesem Zusammenhang ist das humane Hornhautendothel ein
wichtiger Faktor da dessen Funktionen für die Transparenz der Hornhaut von
eminenter Bedeutung sind. Die pathophysiologische Eigenschaften von Horn- und
Bindehautzellen sind von Calcium-abhängigen zellulären Mechanismen abhängig
welche das intrazelluläre Calcium regulieren. Für die Funktion (und das
Überleben) der Zelle ist die Aufrechterhaltung eines extrem niedrigen
Calciumniveaus (10000-fach niedriger als die extrazelluläre
Calciumkonzentration) entscheidend. Hier tragen überwiegend Calciumkanäle wie
z.B. Transient Rezeptor Potenzial (TRP) Kanäle zur Calciumregulation bei. Für
die Steuerung zahlreicher (lebenserhaltender) Zellprozesse und Rezeptoren sind
Ca2+ Ionen als sekundäre Botenstoffe sehr wichtig. Die intrazelluläre
Konzentration dieser Ca2+ Ionen wird im Wesentlichen über die TRP-Kanäle
reguliert. Zahlreiche Erkrankungen assoziieren mit einer anomalen TRP-
Kanalexpression. Daher könnten diese Regulatoren des Ca2+ Einflusses in
Verbindung mit endogenen Modulatoren potenzielle Targets für Entwicklung von
Therapien in der Klinik sein. Die Ergebnisse der in der vorliegenden
Habilitationsschrift durchgeführten Experimente und Literaturrecherchen sollen
im Folgenden aufgeführt werden: 1\. Unter Verwendung von hochsensitiven
funktionellen Methoden wie Fluoreszenz Calcium Imaging und planarer Patch-
Clamp Technik konnten (erstmals) die funktionelle Expression von TRP-Kanälen
wie dem TRPV1 und TRPM8 in humanen Hornhaut- und Bindehautepithelzellen
nachgewiesen werden. Es konnten typische charakteristische Eigenschaften
dieser TRP-Kanäle bestätigt werden. Um weitere Charakteristiken und
pharmakologische Eigenschaften zu validieren wurden weitläufige spezielle
Untersuchungen durchgeführt. 2\. TRPV1 und TRPM8 steuern Prozesse, die von der
Zellmembran in Richtung Zellkern verlaufen. Die Aktivierung der TRP-Kanäle ist
mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) verbunden (GPCR-TRP-Kanal Achse).
Hierbei deuteten sich zwei verschiedene Ca2+ Signalwege an, die über die
Anwendung von sog. Thyronaminen (3-T1AM) ausgelöst wurden. Zum einen bindet
das 3-T1AM an einem Rezeptor (GPCR) und aktiviert TRPV1 Kanäle, die wiederum
die intrazelluläre Ca2+ Konzentration erhöhen. Pilotstudien zeigten, dass hier
-Adrenorezeptoren involviert sind, da ein spezifischer Blocker dieser
Rezeptoren den Ca2+ Anstieg unterdrückte. Zum anderen deutete sich ein
Zusammenspiel zwischen TRPV1 und TRPM8 an, welches letztendlich zu einer
Unterdrückung des Ca2+ Einflusses führte. 3\. Eigene Daten und Daten aus
Kollaborationen weisen auf diverse mögliche Rollen der TRP-Kanäle hin. Zum
einen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von TRPV1 inflammatorische
Zytokine (Interleukine) und Mediatoren für die Proliferation von
Hornhautepithezellen freisetzt. Hierbei erhöht die Aktivierung von TRPV1 das
intrazelluläre Ca2+, welches wiederum mit der Freisetzung von IL-6 im
Speziellen verbunden ist. Zum anderen konnten osmosensitive Eigenschaften von
TRPV1 und TRPV4 in Augenzellen nachgewiesen werden. Selektive Modulation
entweder der TRPV1/TRPV4 Kanäle oder dessen Signalvermittler stellen daher
neuartige Targets für die Unterdrückung von Inflammation dar. Eine weitere
wichtige Rolle von TRPV1 und TRPM8 deutete sich im Zusammenhang mit
Hornhautbanken an. Die Lagerung von Hornhäuten unter normaler Raumtemperatur
(kühle Hornhautlagerung) erhöht die Funktion von TRPM8. Außerdem kann die
spezielle Temperatursensitivität für die Identifikation thermosensitiver TRP-
Kanäle im humanen Hornhautendothel genutzt werden, da einige TRPM8 Modulatoren
pharmakologisch nicht hoch-spezifisch wirken. Überdies weisen die Daten auch
auf eine Involvierung von TRPV1 im Hornhautendothel hin wenn es Temperaturen
über 43 °C während des Transports von der Hornhautbank zum Ophthalmochirurgen
ausgesetzt ist, wobei eine hohe Temperatur die Hornhautendothelzellschicht
beschädigen kann. 4\. Die zuvor genannten Ergebnisse legen wichtige Funktionen
der TRP-Kanäle für die Funktion des gesamten Vorderabschnitts des Auges nahe.
Weitere Untersuchungen zeigten, dass Osmoprotektiva mit kompatiblen Soluten
wie z.B. das L-Carnitin inhibitorisch auf die TRPV1 Kanalaktivität wirken wenn
die Zellen über Hyperosmolarität zum Schrumpfen gebracht wurden. Dies weist
auf eine Assoziation zwischen L-Carnitin und TRPV1 hin, da TRPV1 über
Hyperosmolarität in Hornhautepithelzellen aktiviert werden kann. 5\. Eine
weitere Möglichkeit Inflammation (und auch Schmerz) beim trockenen Auge zu
unterdrücken basiert auf die zuvor genannten Befunde mit Thyronaminen
(3-T1AM). Hierbei könnte 3-T1AM ein TRPM8-spezifischer Ligand sein, da 3-T1AM
spezifisch TRPM8 Kanäle in Hornhautepithel- und Bindehautepithelzellen
aktiviert. Überdies führte eine Vorbehandlung dieser Zellen mit 3-T1AM dazu,
dass nicht nur der TRPV1-induzierte Ca2+ Anstieg unterdrückt werden konnte.
Auch die Freisetzung von Interleukin-6 und damit verbundene inflammatorische
Prozesse konnten unterdrückt werden. 6\. Schließlich wurden auch die
zukünftige Ausrichtung und Limitationen dieser Studien diskutiert. Ein
wichtiger Befund war, dass die TRPM8 Expression nicht nur im HCEC-12
Zellmodell gezeigt werden konnte, sondern auch in
Hornhautendothelprimärzellkulturen (HCEnC). Darüber hinaus zeigten erste
elektrophysiologische Daten, dass die Expression des TRPM8 erstmals auch in
SV40 immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen (HCE-T) bestätigt werden
konnte, die in einem in vitro humanen Hornhautmodell (Hornhautkonstrukt)
verwendet werden.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
dry eye syndrome
dc.subject
corneal endothelium
dc.subject
planar patch-clamp
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Functional expression of temperature-sensitive transient receptor potential
channels (TRPs) in cultured human corneal and conjunctival cells
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Juana Gallar Martinez / Alicante
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Dr. Solon Thanos / Münster
dc.date.accepted
2015-10-19
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000100585-8
dc.title.subtitle
Relevance in the pathophysiology of ocular surface diseases
dc.title.translated
Funktionelle Expression von temperatur-sensitiven Transient Rezeptor Potenzial
(TRP) Kanälen in kultivierten humanen Hornhaut- und Bindehautzellen
de
dc.title.translatedsubtitle
Relevanz und Pathophysiologie von Erkrankungen der Augenoberfläche
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000100585
refubium.note.author
DFG gefördert (ME 1706/13-1; ME 1706/18-1)
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000018082
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access