Development of assays for the detection of agents with bioterroristic potency using the IgY-technology (Avian antibody)

Abstract

The IgY-technology (the non-invasive production of polyclonal Ab in chicken) is a highly innovative and growing branch of biotechnology due to several advantages that IgY-Ab has compared with mammalian Ab. \- Animal welfare. IgY Ab can be easily sampled based on simple action of egg collection and preparation of IgY from egg yolk, instead of the stressful bleeding of animals. \- High amount of IgY (more than tenfold compared to an animal of similar size like a rabbit). \- No cross-reactivity with rheumatoid factors. \- No cross-reactivity with human anti-mouse Ab (so-called HAMA). \- No activation of the mammalian complement system. \- High resistance to immunisation with toxins. In the study presented polyclonal Ab was produced against different agents with bioterroristic background like OPV and different toxins (Ricinus communis and Clostridium botulinum). The immunisations resulted generally in Ab with partly extremely high titres and other different specificities (concerning the different chains of ricin as well as botulinum toxins). It is important to notice that stable and high Ab titre could be achieved by injecting only 20 µg of antigen per immunisation. Neutralizing properties of the Ab under investigation could be shown in vitro and in vivo. It could be proved that the Ab with specificity against OPV is suited for detection of viruses from strongly diluted samples. The procedure is based on a combination of an enrichment technique (binding of virus particles with IgY- coupled magnetic beads) followed by a PCR. A result rather by chance was the observation that there is an apparent correlation between the number of virus particles used for immunisation and the resulting Ab-titre. A more detailed study using the same antigen but with changed concentrations (formerly high concentrated now diluted, and formerly low concentrated now higher concentrated, respectively). The results obtained confirmed the expectations and are also in line with observations of other working groups. Furthermore, it could be demonstrated that the laying hens can lay eggs continuously during a two years period. The laying capacity diminishes approximately during the second half of the second year (2-3 eggs per week compared to 5-7 eggs at the beginning). However, since the IgY concentration is higher in the second year the mean yield of IgY is similar if both years are compared. It could be demonstrated by that hens produce IgY at a rate of about 20 g per year. Interestingly, the IgY concentration follows a complex biological oscillation in a range of a circaseptan rhythm and a multiple of seven. In summarizing, due to the advantages mentioned above chickens are excellently suited for the production of Ab against agents with bioterroristic background and other substances.

Die IgY-Technologie (die nicht-invasive Produktion von polyklonalen Antikörpern in Legehennen) ist ein hoch innovativer und wachsender Zweig der Biotechnologie, zurückzuführen auf verschiedene Vorteile, die diese Technologie gegenüber der Gewinnung von Ak in Säugern hat: Die Methode gilt als Alternative im Sinne des Tierschutzes, da IgY unblutig aus dem Eidotter gewonnen wird. • Große Menge an IgY (mehr denn das Zehnfache, das von einem Säuger vergleichbarer Größe [Kaninchen] erhalten werden kann). • Keine Kreuzreaktion mit rheumatoiden Faktoren. • Keine Kreuzreaktion mit humanen anti-Maus Ak (sogenannten HAMA). • Keine Aktivierung des Säuger- Complementsystems. • Erstaunliche Resistenz gegen Immunisierung mit Toxinen. In der vorgelegten Studie wurden Ak gegen Substanzen mit bio-terroristischem Hintergrund wie OPV und verschiedene Toxine ((Ricinus communis und Clostridium botulinum) produziert. Die Immunisierungen führten generell zu Ak mit teilweise extrem hohen Titern. Ein wichtiges Ergebnis ist auch, dass Antigenmengen von nur 20 µg pro Immunisierung zu hohen und stabilen Ak-Titern führte. Bezogen auf die Reaktionen mit den unterschiedlichen Ketten der genannten Toxine war die Spezifität der generierten Ak unterschiedlich. Darüber hinaus hatten die jeweiligen Ak neutralisierende Eigenschaften in vitro und in vivo. Mit den anti-Orthopxvirus Ak konnte eine Virus-Anreicherung zur Detektion von Viren in stark verdünnten Proben entwickelt werden. Die Methode basiert auf der Bindung von Viren an IgY-gekoppelte magnetic beads, gefolgt von einer PCR. Ein eher zufälliges Ergebnis war die Beobachtung, dass die Anzahl der für die Immunisierung eingesetzten Viruspartikel offensichtlich die Höhe des resultierenden Ak-Titers beeinflusst. Eine gezielte Untersuchung unter Verwendung derselben Antigene (das vorher hochkonzentrierte jetzt verdünnt, das vorher niedrigkonzentrierte jetzt aufkonzentriert) bestätigte diesen Zusammenhang. Dieses Ergebnis entspricht auch Beobachtungen durch andere Arbeitsgruppen. Im Rahmen der Studie konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Legehennen-Rassen kontinuierlich Eier über einen Zeitraum von ca. zwei Jahren legten und damit eine Immunisierung der Tiere über diesen Zeitraum möglich ist. In der zweiten Hälfte des zweiten Jahres reduzierte sich die wöchentliche Legeleistung (2-3 Eier im Unterschied zu 5-7 zu Beginn der Immunisierung). Da aber die IgY-Konzentration im zweiten Jahr deutlich gestiegen ist, sind die IgY-Mengen in beiden Jahren vergleichbar. Die pro Jahr erzielte IgY-Menge liegt in der Größe von 20 g pro Huhn. Überraschenderweise konnte gefunden werden, dass die IgY-Konzentration einer komplexen biologischen Oszillation unterliegt. Es konnte ein circaseptaner Rhythmus gefunden werden, dem Rhythmen mit dem Vielfachen von sieben überlagert sind. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Legehennen aufgrund der oben genannten Vorzüge hervorragend auch zur Produktion von Ak gegen Substanzen mit bioterroristischem Hintergrund geeignet sind.