Context specific signaling of TGF-beta receptor II

Abstract

Der Transformierende Wachstumsfakor beta (TGF-ß) ist maßgeblich an der Steuerung von Entwicklungsprozessen beteiligt, ebenso wie an der Regulation der Homöostase im adulten Organismus. Eine Dysregulation des TGF-ß Signalübetragungswegs steht im Zusammenhang mit Krebs und mit kardiovaskulären und fibrotischen Krankheiten. Erbliche Mutationen in Komponenten dieses Signalwegs bedingen unter anderem die Enstehung von Defekten des muskuloskeletalen und kardiovaskulären Systems. Durch die Erforschung des TGF-ß Signalwegs in den letzten 20 Jahren konnten grundsätzliche Funktionen und Mechanismen seiner Signalübertragung aufgeklärt werden. Gleichzeitig wurde deutlich, daß gerade dem TGF-ß Signalweg eine außergewöhnliche Komplexität und Kontextabhängigkeit innewohnt. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Aspekte des TGF-ß Signalwegs untersucht. Zum einen wurden eine Reihe von neun erblichen Mutationen im TGF-ß Typ II Rezeptor (TßRII) untersucht, die für die Entstehung von Krankheiten verantwortlich sind, welche dem Marfan Syndrom ähneln. Diese Mutationen wurden in biochemischen und zellbasierten Experimenten im Hinblick auf ihre Aktivität in verschiedenen TGF-ß induzierten Signalwegen verglichen, sowie ihre Auswirkungen auf die Proteinstruktur nachvollzogen. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, daß die Balance zwischen dem klassischen TGF-ß Signalweg, an dem die Smad Proteine beteiligt sind, und dem nicht-kanonischen Signalweg, der in der Aktivierung von MAP Kinasen resultiert, von Bedeutung ist. Die Aktivitäten beider Signalwege zusammen scheinen darüber zu entscheiden, ob sich isolierte Aneurysmen der Thoraxaorta bilden, und ob diese mit zusätzlichen Symptomen im Skelett- oder Gesichtsbereich einhergehen. Diese Erkenntnisse tragen zur Klärung der Frage bei, wie verschiedene Mutationen im selben Protein zu unterscheidbaren klinischen Manifestationen führen. Es konnte gezeigt werden, daß die Mutation R460C nicht wie bislang angenommen die Kinaseaktivität des Rezeptors vollständig auslöscht, sondern eine reduzierte, aber signifikante Aktivität aufweist, die allerdings auf den Smad-Signalweg beschränkt ist. In der Tat scheinen sich die klinischen Symptome bei Patienten, die diese Mutation tragen, auf die Bildung von Aortenaneurysmen zu beschänken, während die übrigen untersuchten Mutationen mit zusätzlichen skelettalen und kraniofazialen Veränderungen einhergehen. In einem weiteren Projekt wurde die Signalübertragung einer alternativ gespleißten Isoform des TßRII untersucht. Diese Variante des TßRII, TßRII-B, besitzt eine einzigartige Bindungsspezifität für die drei Isoformen von TGF-ß, welche den TßRII-B vom TßRII abgrenzen. In dieser Studie wurde ein monoklonaler Antikörper hergestellt, der spezifisch den TßRII-B erkennt, und der darüber hinaus als ein hochspezifischer Inhibitor für die Bindung von TGF-ß2 an TßRII-B fungiert, während die Bindung von TGF-ß1 unbeeinflußt blieb. Es konnte gezeigt werden, daß eine zusätzliche Sequenz von 25 Aminosäuren in der Ligandenbindungsdomäne des TßRII-B seine Spezifität bestimmt. Auf diese Weise konnten wichtige Informationen im Hinblick auf die Frage gewonnen werden, wie TßRII-B seine Liganden bindet.

Transforming growth factor ß (TGF-ß) is a modulator in developmental processes and a regulator in homeostasis. Dysregulation of TGF-ß signaling is associated with human diseases such as cancer and cardiovascular disease. Hereditary defects predispose to metabolic, musculoskeletal, and cardiovascular malfunctions. Even though the principal functions and pathways of TGF-ß signaling have been elucidated in the past decades, increasing levels of complexity regarding its role in vivo and its signaling mechanisms have emerged, emphasizing the highly context specific nature of this pathway. In the present work two aspects of TGF-ß signaling were subject to investigation. In one study the biochemical and functional characteristics of hereditary mutations in the kinase domain of the TGF-ß type II receptor (TßRII) which are associated with distinct diseases related to Marfan syndrome (MFS), namely type II MFS, Loeys-Dietz syndrome (LDS), and thoracic aortic aneurysms and dissections syndrome (TAAD) were characterized in biochemical and cell biological experiments. The consequences of these mutations were traced at various levels of the TGF-ß signaling pathway and correlated with their effects on the protein structures. Results from this study suggest that the balance of canonical TGF-ß-Smad signaling and non-canonical ERK signaling is a determinant for the development of thoracic aortic aneurysms and dissections (TAAD) on one hand and additional manifestations including skeletal and craniofacial phenotypes on the other hand. These findings contribute impor- tant information to the unresolved issue of how distinct phenotypes arise from mutations in the same protein. Specifically, TßRII-R460C, which was regarded to disrupt TßRII kinase acitvity before, displayed residual kinase activity and Smad signaling capability. Evaluation of clinical manifestations of TßRII mutations revealed that R460C tends to be associated with milder phenotypes restricted to the development of thoracic aortic aneurysms while additional manifestations were observed for other mutations. Based on these findings it could be concluded that residual Smad signaling by R460C pre- vents skeletal or craniofacial phenotypes but fails to suppress the development of aortic aneurysms. In another project the signaling properties of an alternatively spliced isoform of TßRII, TßRII-B, were investigated. This isoform was shown before to exhibit unique binding specificities for the three known TGF-ß isoforms, TGF-ß1, -2, and -3. Monoclonal antibodies were generated which specifically recognize TßRII-B. Moreover, one of those antibodies had a highly specific inhibitory effect on TßRII-B signaling as it interfered with binding of TGF-ß2 but not of TGF-ß1. It could be shown in this study that the ligand binding specificities of TßRII-B are determined by an insert of 25 amino acids in the TßRII-B ligand binding domain. These findings provide significant insights regarding the mechanism by which different TGF-ß isoforms are bound by TßRII-B to activate TGF-ß signaling.