Identification and characterization of the secretome in neurofibromatosis type 1 tumors

Abstract

Neurofibromatosis type 1 (NF1) is the most common monogenetic disorder with an incidence of 1:2500 (1) and is associated with benign and malignant tumors (neurofibromas) of the nervous system. Plexiform neurofibromas (PNF) are a specific form of NF1 tumors with diffuse and infiltrative growth. They lead to severe growth-associated complications and can transform into malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST). The incidence of MPNST is associated with the individual PNF burden of NF1 patients. At present, only a fraction of NF1 patients with PNF can be identified by physical examination. Although advanced imaging technology monitors internal PNF burden, MPNST cannot be identified. MPNST are usually only detected when symptoms arise and hence too late for successful therapy, making this tumor the main reason for the reduced life span of NF1 patients. However, early presymptomatic NF1 diagnosis is currently unavailable, making it difficult to assess overall PNF tumor burden and therapeutic efficacy or follow-up tumor development. Therefore our working group focussed on the identification of a surrogate serum marker, which should serve as a prognostic indicator for NF1. A surrogate serum marker may provide the basis for identification of cohorts at increased risk for malignant transformation of PNF, and for diagnosis of MPNST prior to symptomatic detection. Moreover, we established a marker profile to avoid relying on a single serum marker. Our data showed higher concentrations of Melanoma inhibitory activity (MIA) in NF1 patient sera compared to healthy controls. Within the NF1 patient cohort only affected individuals with PNF or numerous dermal neurofibromas (cNF) show higher MIA serum levels. For investigation of further surrogate serum markers we performed a screening study. We incorporated proteins, which we assumed to be overexpressed or potentially secreted by PNF or MPNST and considered also proteins which influence tumor growth systemically. Previous investigations showed that a systemic NF1-haploinsufficient environment supports tumor growth in NF1 patients mainly mediated by cells of the innate immune system like mast cells and monocytes. (2). Investigation of available public databases, scientific literature and previous data of our research group lead to a comprehensive list of candidate proteins (n=115). Those proteins were simultaneously analysed in NF1 patients (n=104) using an antibody based micro array. We identified two proteins, which showed altered levels in MPNST-affected NF1 patients only: Insulinlike growth factor-binding protein 1 (IGFBP1) and Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES). In addition, we determined Interleukin 6 (IL-6), Interferon gamma (IFNγ), Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) to be potential markers for NF1 exclusively. Furthermore, we determined the impact of tumor suppressor gene PTEN alterations in MPNST and neurofibromas. PTEN is a modulator of cytokine response and a potential therapeutic target for MPNST therapy. We detected increased methylation of the PTEN promotor in NF1 patients with MPNST, reduced expression and increased tumorigenic potential. In summary, we identified a potential marker profile for earlier NF1 diagnosis, which even allows a differentiation of MPNST. Our findings have been patented as Biomarker zur Diagnostik und Behandlung von Neurofibromatose Typ 1“ (reference 10 2012 020 496.5).

Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist mit einer Inzidenz von 1:2500 (1) die häufigste monogenetische Erkrankung und mit benignen und malignen Tumoren (Neurofibrome) des Nervensystems assoziiert. Die bei etwa 50% der Patienten mit NF1 auftretenden diffus, infiltrativ wachsenden plexiformen Neurofibrome (PNF) können durch Raumforderungen schwere Komplikationen verursachen und zu malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNST) transformieren. Die Wahrscheinlichkeit einer malignen Transformation korreliert mit der PNF- Belastung der NF1-Patienten. Derzeit können PNF und MPNST nur durch eine klinische Untersuchung identifiziert werden. Die Diagnose interner PNF erfolgt über bildgebende Verfahren des ganzen Körpers. Eine MPNST Diagnose ist zur Zeit erst möglich, wenn Symptome auftreten und eine erfolgreiche Behandlung nicht mehr möglich ist. MPNST sind die Hauptursache für die geringere Lebenserwartung von NF1-Patienten. Ein Früherkennungsprogramm für NF1, das sowohl eine frühere Diagnose der Tumorbelastung durch PNF oder der malignen Entartung anzeigt, als auch eine prädiktive Aussage über den generellen Krankheitsverlauf treffen kann, ist derzeit nicht verfügbar. Unsere Arbeitsgruppe hat sich deshalb der Identifizierung von Serummarkern als prognostische Indikatoren gewidmet. Diese sollen mögliche Risikogruppen für die Entwicklung von MPNST erkennen und maligne Tumore sicher diagnostizieren. Statt nur auf einen einzelnen Biomarker, setzten wir auf ein breites Markerprofil. Unsere Daten zeigten in Seren von NF1-Patienten deutlich höhere Melanoma inhibitory activity (MIA)-Konzentrationen als in gesunden Kontrollen. Innerhalb der NF1-Patientengruppe wiesen Personen mit PNF oder besonders vielen dermalen Neurofibromen (cNF) erhöhte MIA-Serumkonzentrationen auf. Zur Identifikation weiterer Serumproteine führten wir eine Screening-Studie durch. Hierfür wurden neben Proteinen, die in PNF und MPNST überexprimiert und potentiell sezerniert werden auch solche Proteine einbezogen, die das Tumorwachstum bei NF1 systemisch beeinflussen könnten. Frühere Untersuchungen zeigten, dass die NF1-haploinsuffiziente systemische Umgebung bei NF1-Patienten das Tumorwachstum fördert, insbesondere auch durch Zellen des angeborenen Immunsystems wie Mastzellen und Monozyten (2). Aus verfügbaren Daten- und Literaturbanken sowie Vordaten der eigenen Arbeitsgruppe wurde eine Liste mit Kandidatenproteinen (n=115) erstellt und an einer NF1-Patientenkohorte (n=104) mittels eines antikörperbasierten Microarrays simultan getestet. Es gelang uns mit dem Insulin-like Growth Factor Binding Protein 1 (IGFBP1) und Regulated on Activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) zwei Proteine zu identifizieren, die spezifisch veränderte Konzentrationen in NF1-Patienten mit MPNST aufwiesen. Des Weiteren konnten wir mit Interleukin 6 (IL-6), Interferon gamma (IFNγ), Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) und Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) vier potentielle NF1-Marker ermitteln, die im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikante Unterschiede im Serum der NF1-Kohorte aufwiesen. Zuletzt befassten wir uns mit der Auswirkung einer Veränderung des Tumorsuppressorgens PTEN in MPNST und Neurofibromen. PTEN ist wesentlich an der Modulierung von Zytokinsignalwegen in MPNST-Zellen beteiligt und ein potentielles therapeutisches Target. Dabei konnten wir verstärkte PTEN-Promotor Methylierungen in MPNST nachweisen, die eine Unterückung der Expression und damit einhergehend erhöhte Tumorigenität der Zellen bewirken kann. Zusammenfassend konnten wir ein potentielles Markerprofil zur früheren Diagnose von NF1 identifizieren, das sogar eine Differenzierung von MPNST erlaubt. Unsere Erkenntnisse wurden unter dem Aktenzeichen 10 2012 020 496.5 als „Biomarker zur Diagnostik und Behandlung von Neurofibromatose Typ 1“ zum Patent eingereicht.