In vitro Endothelialisierung polymerer Oberflächen mittels Aptamertechnologie

Abstract

Die stetig steigende Mortalität aufgrund arteriosklerotischer Erkrankungen ist ein wachsendes Problem unserer Gesellschaft. Bei dieser Erkrankung lagern sich zunehmend Plaques in der Gefäßwand von Blut-gefäßen ab, was im Zusammenspiel mit der Einwanderung glatter Muskelzellen in einer Verringerung des Gefäßlumens resultiert. Die Behandlung dieses Krankheitsbildes mittels invasiver Therapien hat in den vergangenen Jahrzehnten immens an Bedeutung gewonnen und es werden pro Jahr mittlerweile mehr als eine halbe Million Bypass-Operationen durchgeführt. Da häufig geeignete autologe Gefäße fehlen, ist die Implantation synthetischer Surrogate bei vielen Patienten der einzig mögliche therapeutische Ansatz. Die Oberflächen der verwendeten Materialien sind hierbei aufgrund einer unzureichenden Hämokompatibilität autologen Gefäßen unterlegen. Von den zahlreichen Konzepten zur Verringerung der Thrombogenität artifizieller Implantate stellt die Generierung einer natürlichen anti-thrombogenen Schicht durch Besiedlung mit autologen Endothelzellen die vielversprechendste Strategie dar. Die Generierung einer funktionell-konfluenten und scherresistenten Endothelzellschicht gestaltet sich jedoch auf vielen synthetischen Oberflächen schwierig, da sie aufgrund ihrer Grenzflächeneigenschaften keine stabile Endothelialisierung erlauben. Moderne Endothelialisierungsstrategien verwenden daher niedrigmolekulare, zellbindende Liganden wie Peptide, Antikörper oder Aptamere für eine selektive Rekrutierung der Zellen. Da diesen Liganden Valenzen für weitere Interaktionen fehlen, kommt für sie meist nur eine kovalente Immobilisierung in Frage. Verfahren der kovalenten Immobilisierung können sich jedoch durch Alterierung der Substratoberfläche oder Veränderung der biologischen Aktivität der Liganden negativ auf die spätere Anwendung auswirken. Eine Alternative zur kovalenten Immobilisierung zellbindender Liganden ist die Verwendung ebenso optimierter, an das Substrat bindender Moleküle, welche über eine Vielzahl nicht-kovalenter physikalischer Interaktionen nach dem Prinzip der Multivalenz eine stabile Funktionalisierung ermöglichen. Das Screening nach solchen optimiert an die Oberfläche eines polymeren Biomaterials bindenden Liganden wurde mittels eines auf Nukleinsäuren (Aptameren) basierenden in vitro Selektionsverfahrens durchge¬führt. Als ein ideales Material für DNS-Liganden wurde Polyetherimid (PEI) in Form von Filmen ausge¬wählt, da es aufgrund seiner chemischen Struktur und seiner Grenzflächeneigenschaften über eine Vielzahl von Valenzen verfügt, um ausgeprägte physikalische Interaktionen mit DNS-Basen eingehen zu können. Ebenso stellte dieses Polymer durch seine vergleichbar gute Hämo- und Biokompatibilität einen idealen Kandidaten für eine spätere Liganden unterstützte Endothelialisierung dar. Die in vitro Selektion zur Generierung PEI bindender DNS-Aptamere resultierte in der Aufklärung eines durch Thymin dominierten Bindungsmotives. Die bevorzugte Interaktion der Polymeroberfläche mit Thymin war dabei auf die chemische Struktur der Base zurückzuführen und einer damit verbundenen, im Vergleich zu anderen Nukleotidbasen geringeren elektrostatischen Repulsion durch das π-Elektronensystem sowie einer durch den hydrophoben Charakter von Thymin maximierten Entropie. Trotz einer fehlenden Materialselektivität gegenüber anderen Polymeren mit ähnlichen makroskopischen Grenzflächeneigenschaften konnte gezeigt werden, dass eine Generierung von multivalent bindenden Aptameren gegen die Oberfläche des ausgewählten Modellpolymers PEI möglich war und auf deren Grundlage eine bis in den Nanometer¬bereich flächendeckende Beschichtung polymerer Substrate erreicht werden konnte. In nachfolgenden in vitro Bindungsstudien zeigte sich, dass die Aptamerbindung unter dem Einfluss proteinogener Bestandteile instabil war. Dennoch konnte im Rahmen einer Machbarkeitstudie unter Anpassung des Zellkultursystems mit Hilfe der Aptamere ein zellbindender Ligand über nicht-kovalente Biotin/Streptavidin Interaktion auf PEI immobilisiert werden, mit dessen Hilfe die initiale Adhärenz und Scherresistenz von Endothelzellen im Vergleich zum unbehandelten Polymer signifikant verbessert wurde.

The steadily increasing mortality due to atherosclerotic diseases is a growing problem in our society. In this disease the vessel lumen is reduced by deposition of plaques at the wall of blood vessels in combination with smooth muscle cell migration. The treatment of this disorder by means of invasive therapies has become increasingly important in recent decades, so that currently more than half a million bypass surgeries are performed per year. However, often suitable autologous vessels are missing and the implantation of synthetic substitutes is the only possible therapeutic approach for many patients. Here the surfaces of the artificial materials used are inferior to autologous vessels due to insufficient hemocompatibility. There are many concepts for reducing the thrombogenicity of artificial implants, whereby the generation of a natural anti-thrombogenic layer by colonization with autologous endothelial cells is the most promising strategy. However, the generation of a functional-confluent and shear resistant endothelial cell layer is difficult on many synthetic surfaces, since they do not allow stable endothelialization due to its interfacial properties. Therefore modern endothelialization strategies use low-molecular cell-binding ligands such as peptides, antibodies or aptamers for selective cell recruitment. Since these ligands do not have additional valences for further interaction, covalent immobilization is mostly the only possibility to generate a stable surface functionalization. However, methods used for covalent immobilization can cause adverse effects on the subsequent application like an alteration of the substrate surface or changes in the biological activity of the ligand. An alternative to covalent immobilization would be the use of optimized substrate binding molecules for a stable functionalization, which allow a variety of non-covalent physical interactions on the principle of multivalency in the same manner like cell-binding ligands. The screening for such optimized to the surface of a polymeric biomaterial binding ligands was carried out by means of an on nucleic acids (aptamers) based in vitro selection process. As an ideal candidate material for DNA-ligands polyetherimide (PEI) was selected in the form of films, as it has a variety of valences to interact by physical forces with DNA bases, based on its chemical structure and interface properties. Furthermore this polymer exhibited a comparatively good hemo- and biocompatibility. The in vitro selection for the generation of PEI binding DNA-aptamers resulted in the clarification of thymine dominated binding motive. The preferential interaction of the polymeric surface with thymine was attributed to the chemical structure of the base, which was connected with a decreased electrostatic repulsion of the π-electron system as well as the hydrophobic character maximizing entropy. Despite of a lack of material selectivity with regard to other polymers showing similar macroscopic interfacial properties, the generation of multivalent binding aptamers against the surface of the selected model polymer PEI could be shown. On the basis of these ligands an up to the nanometer range area wide coating of the polymeric substrate could be achieved. In subsequently performed in vitro binding studies it was elucidated, that the aptamer coating was instable under the influence of proteinogenic components in the surrounding fluid. Nevertheless, by adjusting the cell culture system, the non-covalent immobilization of a cell binding ligand, via non-covalent biotin/streptavidin interaction, with the surface bound aptamers was shown in a proof of concept, whereby the initial adherence and shear resistance of endothelial cells was significantly improved compared to the untreated polymer.