dc.contributor.author
Orak, Banu
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:41:31Z
dc.date.available
2016-09-16T10:57:23.958Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13726
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17924
dc.description.abstract
Das Familiäre Mittelmeerfieber (FMF) ist das häufigste autoinflammatorische
Fiebersyndrom. Pathophysiologisch liegt der Erkrankung eine “gain-of-function“
Mutation im MEFV-Gen zu Grunde. Durch die Aktivierung eines ASC-abhängigen und
NLRP3-unabhängigen Inflammasoms kommt es zu unregelmäßigen Schüben mit Fieber
und Serositis. Histopathologisch führen diese molekulargenetischen
Veränderungen zu einem Neutrophileneinstrom in die betroffenen Organe. S100
Proteine und pro-inflammatorische Zytokine werden bei unbehandelten Patienten
und Patienten mit einem instabilen Krankheitsverlauf vermehrt sezerniert.
Diese scheinen für den Nachweis einer Inflammation sensibler als klassische
Inflammationsmarker. Ziel dieser Arbeit war es die ex-vivo
Inflammasomaktivität und S100 Proteine in Granulozyten und PBMCs nach
Stimulation bei Patienten mit einem instabilem FMF zu untersuchen. Zusätzlich
wurde auf mRNA Ebene die Transkription dieser Proteine gemessen. Sechs
Patienten mit der gesicherten Diagnose eines FMF und nachgewiesener Mutation,
entweder homozygot oder compound-heterozygot für M694V, wurden in die Arbeit
eingeschlossen. Trotz Colchizintherapie hatten die Patienten weiterhin Schübe
und erhöhte Inflammationsmarker (“instabiler Krankheitsverlauf“). Vier gesunde
Probanden dienten als Kontrollen. Mit Hilfe eines Fragenbogens wurde ihr
Gesundheitszustand erfragt. Von allen Teilnehmern lag ein schriftliches
Einverständnis vor. Jedem Probanden wurde 25-30 ml Blut abgenommen und
Granulozyten und PBMCs durch eine Zweidichtezentrifugation getrennt. Für jeden
Ansatz wurden 5 x 106 Zellen stimuliert: (i) ohne Zusatz von Stimulanzien,
(ii) PMA (10 nM), (iii) LPS (10 ng/ml) und (iv) LPS (10 ng/ml) + ATP (1 mM)
(letztere Substanz am Ende für 30 Minuten). Gleichzeitig wurden dieselben
Ansätze parallel mit Colchizin (5 mg/ml) inkubiert. Die Überschüsse wurden
eingefroren und daraus später ELISAs für S100A8/9, S100A12, IL-1ß, IL-18 und
Caspase-1 durchgeführt. Aus den Zellpellets erfolgten RT-PCRs für obige
Proteine. Ein Blutbild und das CrP wurden aus den anfangs abgenommenen
Blutproben bestimmt. Es zeigte sich eine gesteigerte Sekretion für S100A12,
S100A8/9, IL-18 und Caspase-1 in den Neutrophilen von instabilen FMF
Patienten, die im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant war. Durch die
Stimulation kam es zu keiner Zunahme der Sekretion. Die Zugabe von Colchizin
führte zu einer starken Abnahme der Hypersekretion von S100A12, S100A8/9,
IL-18 und Caspase-1. Die Messungen in PBMCs zeigten keine hohen
Sekretionswerte. Beim Vergleich der Transkription der oben genannten Zytokine
ergaben sich keine Unterschiede zwischen den beiden Vergleichsgruppen.
Zusammengefasst tragen eine spontane Inflammasomaktivierung und S100 Proteine
gleichermaßen zur Inflammation beim FMF bei. Es konnte bestätigt werden, dass
Patienten mit einem instabilen Krankheitsverlauf und der “high-risk“ Mutation
M694V trotz Colchizintherapie weiterhin eine Krankheitsaktivität aufweisen.
de
dc.description.abstract
Familial Mediterranean fever (FMF) is the most common autoinflammatory fever
syndrome. Pathophysiologically gain-of-function pyrin mutations cause
unprovoked attacks by altering an ASC-dependent NLRP3-independent inflammasome
leading to fever and serositis. Histopathologically, these moleculargenetic
changes lead to a predominant neutrophilic infiltration at the affected sites.
S100 proteins and other inflammatory cytokines are highly secreted in
untreated and instable FMF. Furthermore, these molecules might detect
inflammation more sensitive than the classical biomarkers. The objective of
this study was to assess the ex vivo inflammasome activity and S100 protein
secretion in granulocytes and PBMC´s after various kinds of cell stimulation
from patients with unstable FMF. Furthermore, mRNA levels for all cytokines
were measured. Six turkish patients with the clinical diagnosis of FMF,
homozygous or combined heterozygous for the high-risk mutation M694V, were
included. Patients still exhibited attacks and elevated inflammation markers
despite sufficient colchicine therapy (“instable disease”). Healthy probands
served as controls. Their health status was assessed by a standardized
questionnaire. All patients and controls gave written consent. From each
participant 25-30 ml blood was drawn and PBMC´s and granulocytes separated by
a two density gradient centrifugation. 5 x 106 cells were stimulated with (i)
mock, (ii) PMA (10 nM), (iii) LPS (10 ng/ml) and (iv) LPS (10 ng/ml) + ATP (1
mM) (latter substance for the last 30 minutes). Simultaneously in another
approach cells were treated with additional colchicine (5 mg/ml) for the whole
incubation time. Supernatant was gained and frozen at -20°C. ELISA for
S100A8/9, S100A12, IL-1ß, IL-18 and Caspase-1 was performed. Cell pellets were
used for RT-PCR to quantify mRNA levels. At the time of blood drawing high
sensitivity CRP and blood counts were measured. Compared to controls even
unstimulated granulocytes from FMF patients with instable disease secreted
significantly more S100A12, S100 A8/9, Interleukin-18 and Caspase-1.
Stimulation did not increase secretion. Supplementary colchicine significantly
suppressed the hypersecretion of S100A12, S100 A8/9, IL-18 and Caspase-1. In
PBMCs, the result showed no increase of secretion. There were no differences
when transcriptional levels of these cytokines were compared between both
groups. Taken together, spontaneous inflammasome-activation and S100 proteins
contribute equally to inflammation in FMF. These data confirm that unstable
patients with the high-risk mutation M694V still exhibit inflammatory activity
despite colchicine treatment.
en
dc.format.extent
88 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
familial Mediterranean fever
dc.subject
autoinflammation
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Ex vivo Inflammasomaktivität in Leukozyten von Patienten mit homozygoter
MEFV–Gen Mutation
dc.contributor.contact
banu.orak@charite.de
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2016-09-09
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000102707-2
dc.title.translated
Ex vivo inflammasome activity in leukocytes of patients with homozygous MEFV-
gene mutation
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000102707
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000019754
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access