Ex vivo Inflammasomaktivität in Leukozyten von Patienten mit homozygoter MEFV–Gen Mutation

Abstract

Das Familiäre Mittelmeerfieber (FMF) ist das häufigste autoinflammatorische Fiebersyndrom. Pathophysiologisch liegt der Erkrankung eine “gain-of-function“ Mutation im MEFV-Gen zu Grunde. Durch die Aktivierung eines ASC-abhängigen und NLRP3-unabhängigen Inflammasoms kommt es zu unregelmäßigen Schüben mit Fieber und Serositis. Histopathologisch führen diese molekulargenetischen Veränderungen zu einem Neutrophileneinstrom in die betroffenen Organe. S100 Proteine und pro-inflammatorische Zytokine werden bei unbehandelten Patienten und Patienten mit einem instabilen Krankheitsverlauf vermehrt sezerniert. Diese scheinen für den Nachweis einer Inflammation sensibler als klassische Inflammationsmarker. Ziel dieser Arbeit war es die ex-vivo Inflammasomaktivität und S100 Proteine in Granulozyten und PBMCs nach Stimulation bei Patienten mit einem instabilem FMF zu untersuchen. Zusätzlich wurde auf mRNA Ebene die Transkription dieser Proteine gemessen. Sechs Patienten mit der gesicherten Diagnose eines FMF und nachgewiesener Mutation, entweder homozygot oder compound-heterozygot für M694V, wurden in die Arbeit eingeschlossen. Trotz Colchizintherapie hatten die Patienten weiterhin Schübe und erhöhte Inflammationsmarker (“instabiler Krankheitsverlauf“). Vier gesunde Probanden dienten als Kontrollen. Mit Hilfe eines Fragenbogens wurde ihr Gesundheitszustand erfragt. Von allen Teilnehmern lag ein schriftliches Einverständnis vor. Jedem Probanden wurde 25-30 ml Blut abgenommen und Granulozyten und PBMCs durch eine Zweidichtezentrifugation getrennt. Für jeden Ansatz wurden 5 x 106 Zellen stimuliert: (i) ohne Zusatz von Stimulanzien, (ii) PMA (10 nM), (iii) LPS (10 ng/ml) und (iv) LPS (10 ng/ml) + ATP (1 mM) (letztere Substanz am Ende für 30 Minuten). Gleichzeitig wurden dieselben Ansätze parallel mit Colchizin (5 mg/ml) inkubiert. Die Überschüsse wurden eingefroren und daraus später ELISAs für S100A8/9, S100A12, IL-1ß, IL-18 und Caspase-1 durchgeführt. Aus den Zellpellets erfolgten RT-PCRs für obige Proteine. Ein Blutbild und das CrP wurden aus den anfangs abgenommenen Blutproben bestimmt. Es zeigte sich eine gesteigerte Sekretion für S100A12, S100A8/9, IL-18 und Caspase-1 in den Neutrophilen von instabilen FMF Patienten, die im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant war. Durch die Stimulation kam es zu keiner Zunahme der Sekretion. Die Zugabe von Colchizin führte zu einer starken Abnahme der Hypersekretion von S100A12, S100A8/9, IL-18 und Caspase-1. Die Messungen in PBMCs zeigten keine hohen Sekretionswerte. Beim Vergleich der Transkription der oben genannten Zytokine ergaben sich keine Unterschiede zwischen den beiden Vergleichsgruppen. Zusammengefasst tragen eine spontane Inflammasomaktivierung und S100 Proteine gleichermaßen zur Inflammation beim FMF bei. Es konnte bestätigt werden, dass Patienten mit einem instabilen Krankheitsverlauf und der “high-risk“ Mutation M694V trotz Colchizintherapie weiterhin eine Krankheitsaktivität aufweisen.

Familial Mediterranean fever (FMF) is the most common autoinflammatory fever syndrome. Pathophysiologically gain-of-function pyrin mutations cause unprovoked attacks by altering an ASC-dependent NLRP3-independent inflammasome leading to fever and serositis. Histopathologically, these moleculargenetic changes lead to a predominant neutrophilic infiltration at the affected sites. S100 proteins and other inflammatory cytokines are highly secreted in untreated and instable FMF. Furthermore, these molecules might detect inflammation more sensitive than the classical biomarkers. The objective of this study was to assess the ex vivo inflammasome activity and S100 protein secretion in granulocytes and PBMC´s after various kinds of cell stimulation from patients with unstable FMF. Furthermore, mRNA levels for all cytokines were measured. Six turkish patients with the clinical diagnosis of FMF, homozygous or combined heterozygous for the high-risk mutation M694V, were included. Patients still exhibited attacks and elevated inflammation markers despite sufficient colchicine therapy (“instable disease”). Healthy probands served as controls. Their health status was assessed by a standardized questionnaire. All patients and controls gave written consent. From each participant 25-30 ml blood was drawn and PBMC´s and granulocytes separated by a two density gradient centrifugation. 5 x 106 cells were stimulated with (i) mock, (ii) PMA (10 nM), (iii) LPS (10 ng/ml) and (iv) LPS (10 ng/ml) + ATP (1 mM) (latter substance for the last 30 minutes). Simultaneously in another approach cells were treated with additional colchicine (5 mg/ml) for the whole incubation time. Supernatant was gained and frozen at -20°C. ELISA for S100A8/9, S100A12, IL-1ß, IL-18 and Caspase-1 was performed. Cell pellets were used for RT-PCR to quantify mRNA levels. At the time of blood drawing high sensitivity CRP and blood counts were measured. Compared to controls even unstimulated granulocytes from FMF patients with instable disease secreted significantly more S100A12, S100 A8/9, Interleukin-18 and Caspase-1. Stimulation did not increase secretion. Supplementary colchicine significantly suppressed the hypersecretion of S100A12, S100 A8/9, IL-18 and Caspase-1. In PBMCs, the result showed no increase of secretion. There were no differences when transcriptional levels of these cytokines were compared between both groups. Taken together, spontaneous inflammasome-activation and S100 proteins contribute equally to inflammation in FMF. These data confirm that unstable patients with the high-risk mutation M694V still exhibit inflammatory activity despite colchicine treatment.