Regulation der inflammatorischen Antwort von Makrophagen durch die Histondeacetylase 5

Abstract

Einleitung: In der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED) kommt es insbesondere durch eine überbordende Immunantwort der Makrophagen zu einer Dysregualtion des mukosalen Immunsystems. Aufgrund des bereits bekannten regulatorischen Effektes der Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitoren auf die Makrophagenaktivität wird ein therapeutischer Nutzen der HDAC-Inhibitoren für CED diskutiert. Um zu überprüfen, ob die entzündungshemmende Aktivität durch HDAC5 vermittelt wird, wurde die Regulation der HDAC5-Expression durch inflammatorische Stimuli sowie die immunregulatorische Funktion der HDAC5 in Makrophagen untersucht. Methodik: Die basale HDAC5-Expression wurde in murinen und humanen primären Zellen sowie murinen RAW 264.7- und humanen U937-Zelllen auf messenger-Ribonukleinsäure-Ebene bzw. durch Western-Blot auf Proteinebene nachgewiesen. Die Auswirkung inflammatorischer Stimuli auf die HDAC-Expression wurde mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) in RAW 264.7-Zellen untersucht. Parallel wurde ein transienter knock down durch Transfektion von small interfering-Ribonukleinsäuren bzw. eine Überexpression der HDAC5 durch Plasmid-Transfektion in den Makrophagen-Zelllinien etabliert. Der Effekt auf die Sekretion inflammatorischer Zytokine, die Aktivierung des nukleären Faktor κB (NFκB) und die Expression anderer HDACs wurde durch cytometric bead array und enzyme-linked immunosorbent assay sowie Reporterplasmid-Transfektion mit anschließender Biolumineszenzmessung bzw. qPCR ermittelt. Ergebnisse: HDAC5 wurde in humanen und murinen primären Zellen sowie den beiden murinen und humanen Zellinien exprimiert. Eine kurzfristige Stimulation von RAW 264.7-Zellen mit Lipopolysaccharid führte zu einer signifikanten Steigerung der HDAC5-Expression. Die Überexpression der HDAC5 bewirkte eine erhöhte Sekretion von Tumornekrosefaktor α und monocyte chemoattractant protein-1, eine vermehrte Aktivierung des NFκB-Signalweges sowie eine gesteigerte Expression der HDAC3 in RAW 264.7-Zellen. Dabei war der pro-inflammatorische Effekt der HDAC5 abhängig von der Aktivität der HDAC- Domäne. In Übereinstimmung mit den Daten der Überexpression führte eine verminderte HDAC5-Expression sowohl in den murinen RAW 264.7-Zellen als auch in den humanen U937-Zellen zu einer verminderten Sekretion pro- inflammatorischer Zytokine und in RAW 264.7-Zellen zu einer verringerten Expression der HDAC3. Durch eine längere Lipopolysaccharid-Stimulation bis zu sieben Stunden wurde die Expression der HDAC5 wie auch der anderen HDACs der Klasse II in RAW 264.7-Zellen vermindert, wohingegen die Expression von Vertretern der Klasse I wie HDAC1, 2 und 3 vorrübergehend gesteigert wurde. Schlussfolgerung: Die Expression der HDAC5 in Makrophagen wird durch inflammatorische Stimuli moduliert und reguliert die Immunantwort dieser Zellen. Dabei führt eine vermehrte HDAC5-Expression zu einer gesteigerten Entzündungsreaktion der Makrophagen durch Aktivierung des NFκB-Signalweges und zu einer vermehrten Expression der HDAC3. Die Identifizierung dieser pro- inflammatorischen Rolle der HDAC5 identifiziert sie als eine mögliche Zielstruktur für die Therapie chronisch entzündlicher Darmerkankungen.

Introduction: Overwhelming immune response by macrophages is a crucial factor in the dysregulation of the mucosal immunity, which takes part in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). General inhibition of histone deacetylases (HDACs) modulates the immunological functions of macrophages. Therefore HDAC-inhibitors are considered as therapeutic options for IBD. Analysing the immunological function and the regulation of HDAC5 expression in macrophages should identify the contribution of individual HDAC to the overall anti-inflammatory effect of general HDAC-inhibition. Experimental procedures: Expression of HDAC5 in murine and human primary macrophages as well as murine RAW 264.7 and human U937 cell lines was assessed at messenger ribonucleic acid level and by Western-blot analysis at protein level. The regulatory effect of inflammatory stimuli on the expression of HDACs was analysed in RAW 264.7 cells by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Transient knock down by transfection of small interfering ribonucleic acid and overexpression of HDAC5 by transfection of plasmid constructs was established in both cell lines. The impact on secretion of pro- inflammatory cytokines, activation of the nuclear factor κB (NFκB) as well as expression of other HDAC subtypes was evaluated by cytometric bead array and enzyme-linked immunosorbent assay as well as by transfection of reporter plasmid with subsequent bioluminescence measurements and qPCR. Results: Murine and human primary macrophages as well as murine RAW 264.7 and human U937 cells expressed low baseline levels of HDAC5. Short-term stimulation of RAW 264.7 cells with bacterial lipopolysaccharide significantly increased the expression of HDAC5. Secretion of tumor necrosis factor α and monocyte chemoattractant protein-1, activation of NFκB signaling and expression of HDAC3 was enhanced by overexpression of HDAC5 in RAW 264.7 cells. This pro-inflammatory effect was dependent on the HDAC domain conferring enzymatic activity. Consistently, knock down of HDAC5 resulted in lower secretion of pro-inflammatory cytokines in RAW 264.7 cells as well as U937 cells and in a reduced expression of HDAC3 in RAW 264.7 cells. Long-term stimulation of RAW 264.7 cells up to seven hours diminished the expression of HDAC5 and other class II HDACs, whereas the expression of class I HDACs like HDAC1, 2 and 3 was transiently upregulated. Conclusion: The expression of HDAC5 in macrophages is influenced by inflammatory stimuli and regulates the immune reaction of these cells. Increased expression of HDAC5 induces a pro-inflammatory response of macrophages by activating NFκB-signaling and augmented expression of HDAC3. Definiton of this pro-inflammatory function of HDAC5 enables the inhibiton of an individual HDAC subtype for therapy of IBD.