Neuartige Mobilisierungsstrategien für die myokardiale Regeneration nach akutem Herzinfarkt

Abstract

Einleitung: Die koronare Herzkrankheit und der hieraus resultierende Myokardinfarkt zählen weltweit zu einer der Haupttodesursachen. Trotz der Fortschritte im Bereich der Diagnosestellung und revaskularisierenden Therapie, erleiden viele Patienten aufgrund der Umbauprozesse nach einem akuten Myokardinfarkt (AMI) eine Herzinsuffizienz. Bis heute wurde noch keine ausreichende Therapie entwickelt, um den Herzmuskel zu regenerieren und bereits untergegangenes Myokard zu revitalisieren. Wie in mehreren Studien gezeigt wurde, führt ein AMI zu einer physiologischen Mobilisierung von endothelialen Progenitorzellen (EPC) aus dem Knochenmark (KM) in das periphere Blut. Dennoch sind diese intrinsischen Mechanismen nicht ausreichend, um eine vollständige Regeneration zu bewirken. Aus diesem Grund stellt ein Ansatzpunkt zur Verbesserung der kardialen Funktion die Mobilisierung von EPC zum ischämischen Gebiet dar, um dort mittels der Realisierung einer effektiven Neovaskularisation die endogene Regeneration zu verbessern. In dieser Arbeit wurden verschiedene Wirkstoffe und Wirkstoffkombinationen angewendet, die das Potenzial besitzen, Stamm- und Progenitorzellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut zu mobilisieren. Nachfolgend wurden die potenziellen förderlichen Effekte der mobilisierten hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen (HSPC) und EPC auf die kardiale Regeneration im murinen Herzinfarktmodell untersucht. Methoden: Mittels Ligatur der linken Koronararterie wurde bei 177 FVB/N Mäusen ein Herzinfarkt induziert. Zuvor wurden die Tiere in sechs Behandlungsgruppen randomisiert und nach erfolgter Operation die Wirkstoffe G-CSF (engl. granulocyte-colony stimulating factor), VEGF (engl. vascular endothelial growth factor), AMD3100 oder der Kombination aus GCSF/AMD3100 bzw. VEGF/AMD3100 subkutan appliziert. Die Administration von G-CSF, respektive VEGF wurde 1 h nach der OP (Tag 1) begonnen und erfolgte an den beiden folgenden Tagen (Tag 2 und 3). An Tag 4 wurde der Wirkstoff AMD3100 injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt anstelle der Wirkstoffe Injektionen mit physiologischer Kochsalzlösung. An den Tagen 0, 7, 14 und 28 wurden Blutproben zur weiterführenden Untersuchung aus der Schwanzvene entnommen. Nach der anschließenden Isolation der HSPC und EPC aus dem peripheren Blut erfolgte die durchflusszytometrische Untersuchung der Zellen mithilfe der FACS-Analyse (engl. fluorescence-activated cell sorting). Nach 28 Tagen wurden mittels Katheteruntersuchungen hämodynamische Parameter aufgezeichnet, um die ventrikuläre Funktion zu beurteilen. Nach der Euthanasie der Mäuse und Entnahme der Herzen wurden histologische Untersuchungen zur Bestimmung der Kapillardichte im kardialen Gewebe durchgeführt. Des Weiteren erfolgten die Infarktgrößenmessung und die Bestimmung der linksventrikulären Fibrose. Ergebnisse: Die Analyse des peripheren Blutes zeigte bei allen Gruppen einen Anstieg der mobilisierten HPSC und EPC nach induziertem Herzinfarkt. In der Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass die Gruppe, die eine kombinierte Therapie mit VEGF und AMD3100 erhielt, am effektivsten Flk-1+/Sca-1+-EPC in das periphere Blut mobilisierte. Auch hinsichtlich der CD31+-Zellen in der Immunfluoreszenz-Färbung der Herzen konnte in der „Borderzone“ eine signifikant höhere Anzahl an Kapillaren in der mit VEGF/AMD3100 behandelten Gruppe nachgewiesen werden. Die verbesserte Neoangiogenese führte konsekutiv zu einer Reduktion der Infarktgröße und somit zu einer gut erhaltenen Pumpfunktion nach induziertem Myokardinfarkt, welche sich auch in einer erhöhten Überlebensrate äußerte. Im Gegensatz dazu konnte bei den Mäusen, die mit VEGF resp. AMD3100 alleine sowie bei den mit G-CSF und G-CSF/AMD3100 behandelten Mäusen keine Verbesserung der linksventrikulären Pumpfunktion beobachtet werden. Auch im Hinblick auf die Infarktgröße, die Vaskularisation des ischämischen Myokards und die Überlebensrate wurden bei diesen Wirkstoffgruppen keine förderlichen Effekte auf die myokardiale Regeneration festgestellt. Diskussion: Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kombinierte Therapie mit VEGF/AMD3100 nicht nur die endogene Mobilisation der EPC fördert, sondern dass die rekrutierten Zellen auch zu einer verbesserten myokardialen Neovaskularisation beitragen, welche sich nachfolgend positiv auf die Herzfunktion nach stattgehabtem AMI auswirkt. Dieser Effekt ließ sich bei den Mäusen, die singuläre Wirkstoffe oder die kombinierte Behandlung mit G-CSF und AMD3100 erhielten, nicht beobachten. So führte zum Beispiel die alleinige Gabe von VEGF zu einer Ausbildung von abnorm großen vaskulären Strukturen. Auch bei der Administration von G-CSF bzw. der Kombination von G-CSF und AMD3100 wurden nachteilige Effekte im Hinblick auf die myokardiale Regeneration nach AMI beobachtet, wie beispielsweise das vermehrte Auftreten von Perikarditiden. Resümierend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit zum ersten Mal demonstriert wurde, dass die Co-Administration mit VEGF und AMD3100 im Hinblick auf die EPC-Mobilisation, die Vaskularisation im ischämischen Myokard, die Erhaltung der Herzfunktion nach AMI und die damit verbundene erhöhte Überlebensrate effektiver ist als die alleinige Gabe der jeweiligen Wirkstoffe bzw. die Behandlung mit G-CSF resp. G-CSF/AMD3100. Die Verwendung dieser neuartigen kombinierten Mobilisierungsstrategie, die weder eine aufwendige ex-vivo Zellaufreinigung benötigt, noch mit der risikoreichen intrakoronaren respektive intramyokardialen Transplantation von Stammzellen verbunden ist, könnte eine therapeutische Alternative für zukünftige klinische Versuche im Hinblick auf die kardiale Regeneration nach AMI darstellen.

Introduction: Coronary heart disease and the resulting myocardial infarction include one of the leading causes of death worldwide. Despite the progress made in the field of diagnosis and therapy, many patients suffer from heart failure after acute myocardial infarction (AMI) as a result of the restructuring processes. Until today, no adequate treatment option has been developed to regenerate the heart muscle and revitalize already lost myocardial tissue. As has been shown in several studies, an AMI leads to a physiological mobilization of endothelial progenitor cells (EPC) from the bone marrow into the peripheral blood. However, these intrinsic mechanisms are insufficient to bring about a full recovery. Therefore, one of the most promising approaches to support endogenous regeneration is the establishment of an effective neovascularization via recruitment of EPC into ischemic heart tissue. In this work various drugs and drug combinations have been applied, which have the potential to mobilize stem and progenitor cells from the bone marrow into the peripheral blood. For this reason the potential beneficial effects of mobilized hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) and EPC on the cardiac regeneration in the murine myocardial infarction model were investigated. Methods: AMI was induced in 177 FVB/NJ mice by ligation of the left coronary artery. The animals were randomized into six treatment groups and the active G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), AMD3100 or the combination of G-CSF/AMD3100 or VEGF/AMD3100 was administered subcutaneously after surgery. The application of G-CSF and VEGF started 1 h post OP (day 1) and was continued on the two following days (day 2 and 3). The active ingredient AMD3100 was injected on day 4. The control group received injections of saline instead of the active ingredients. Blood samples for further examination from the tail vein were collected on days 0, 7, 14 and 28. HSPC and EPC were isolated from the peripheral blood and progenitor cell numbers were evaluated by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis. After 28 days, hemodynamic parameters were recorded to assess the ventricular function by means of catheter examinations. After sacrificing the mice and removal of the heart, histological studies to determine the capillary density in the cardiac tissue were performed. Furthermore infarct size and left ventricular fibrosis were measured. Results: The analysis of peripheral blood in all groups showed a rise of mobilized HPSC and EPC after induced heart attack. In Flow Cytometry we could demonstrate that the group that received the combined therapy with VEGF and AMD3100 mobilized most effective Flk-1+/Sca-1+ EPC into the peripheral blood. Immunofluorescence staining of CD31 EPC marker in the infarcted left ventricle demonstrated significantly enhanced capillary density in the heart tissues of VEGF/AMD3100 treated mice. The improved neovascularization consecutively led to a reduction of the infarct tissue and a well-preserved pumping function after induced myocardial infarction, which manifested itself in an increased survival rate. In contrast to this no improvement of left ventricular pump function could be observed in the mice treated with AMD3100 respectively VEGF alone, as well as in the mice treated with GCSF or G-CSF/AMD3100. No beneficial effects on the myocardial regeneration were observed in regard to the infarct size, vascularization of the ischemic myocardium and the survival rate in these groups of active ingredients. Discussion: The results indicate that the combined therapy with VEGF/AMD3100 not only promotes the endogenous mobilization of the EPC, but that the recruited cells also contribute to an improved myocardial neovascularization with positive affects on heart function after AMI. This effect was not observed in the mice who received singular active substances or the combined treatment with G-CSF and AMD3100. So for example the sole administration of VEGF led to a formation of abnormally large vascular structures. Adverse effects in terms of the myocardial regeneration were also observed in the administration of G-CSF or the combination of G-CSF and AMD3100 after AMI, like for example the increased occurrence of pericardial inflammation. In conclusion our study demonstrates that co-administration of VEGF and AMD3100 is more effective than each drug alone or treatment with G-CSF respectively G-CSF/AMD3100 with regard to EPC mobilization, myocardium vascularization, preservation of heart function after AMI and preventing cardiac death. The use of this new combinatorial therapy that does not require ex vivo cell purification and intracoronary or intramyocardial injection of stem cells may become a therapeutic alternative for future clinical trials for cardiac repair after AMI.