dc.contributor.author
Sydow, Karl
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:37:59Z
dc.date.available
2015-02-17T08:51:54.394Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1371
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5573
dc.description.abstract
Die Darstellung von Lipopeptiden und die Herstellung Lipopeptid-modifizierter
Trägersysteme erfolgte analog zur Leitstruktur von P2A2. Die kovalente
Kopplung von 2 Palmitoylketten (P2) am N-Terminus der Peptidsequenz bildet die
Grundlage für die Generierung und Modifizierung nanopartikulärer Strukturen.
Es konnte gezeigt werden, dass die Dipalmitoylierung auch bei oligo-
Arginin(P2R12)-, oligo-Lysin(P2K12)- und oligo-Glutaminsäuresequenzen (P2E12)
zur Aggregation zu Mizellen im mikromolaren Bereich führt, deren Stabilität
sich jedoch unterscheidet. Zusätzlich ermöglicht die zweifache
Palmitoylierung eine stabile Bindung der Lipopeptide in die Lipiddoppelschicht
von Liposomen. Größenuntersuchungen ergaben für Lipopeptid-Mizellen einen
Durchmesser von 10- 15 nm. Das Oberflächenpotential der Peptidmizellen war
abhängig von der Peptidsequenz entweder positiv bzw. negativ. Die PEG-Ketten
von Lipopeptid-PEG-PE-Mizellen maskieren die Ladung der Peptidsequenz, wodurch
nur geringe Änderungen des Potentials von PEG-PE-Mizellen zu beobachten war.
Lipopeptid-modifizierte Liposomen wurden in den Größenklassen 25 und 100 nm
hergestellt. Je nach molarem Peptid-zu-Lipid-Verhältnis kommt es bei
Liposomen zur Veränderung des Zetapotentials entsprechend der
Ladungseigenschaften der Peptidsequenz. Zudem konnte gezeigt werden, dass
P2R12, P2K12 und P2E12 die Integrität von Liposomen auch bei längerer
Lagerung nicht stören. Die Bildung einer amphipathischen α-Helix, wie es nur
bei P2A2 zu beobachten war, führt zur Störung der Lipiddoppelschicht.
Aufnahmeuntersuchungen Lipopeptid-modifizierter Nanopartikel wurden an
Kapillarendothelzellen des Gehirns (HBMEC) und an Aortenendothelzellen (HAoEC)
durchgeführt. Die Lipopeptid-Mizellen und Liposomen zeigten keine
zytotoxischen Eigenschaften bis zu einer Konzentration von 5 μM und auch die
Inkubation über 4 Stunden mit P2R12 Liposomen hatten keine Einfluss auf die
Viabilität von Hirnkapillarendothelzellen. Die Aufnahmeuntersuchungen zeigten
unterschiedliche Aufnahmemuster in Abhängigkeit von der Peptidsequenz,
Besetzungsdichte und Größe des Trägersystems. Lipopeptidmizellen zeigten die
höchste Interaktion mit den Zellen. Eine verbesserte Aufnahme in HBMEC
gegenüber HAoEC konnte für P2A2- und P2R12-Mizellen beobachtet werden. Auch
P2R12-modifizierte Liposomen zeigten eine Selektivität gegenüber
Hirnkapillarendothelzellen, die bei anderen Lipopeptidliposomen (P2A2, P2K12)
nicht gefunden wurde. Die selektive P2R12-vermittelte Aufnahme ist somit
unabhängig von der Peptidbesetzungsdichte und der Größe der Trägersysteme.
Für das Lipopeptid P2A2 hingegen ist eine hohe Peptiddichte und eine geringe
Trägergröße Voraussetzung für eine selektive Aufnahme in
Hirnkapillarendothelzellen. P2A2-Mizellen und P2R12-Systeme werden Clathrin-
vermittelt internalisiert. Dies spricht für eine Aufnahme nach Bindung an
zellmembranständige Proteoglykane. Ein hohes Expressionslevel an
Proteoglykanstrukturen, speziell Syndecan-2, wurde für Hirnendothelzellen
gezeigt, was somit als primärer Bindungspartner anzusehen ist. Die Xe-
basierte Hyper-CEST MRT ist eine nicht-invasive Methode mit ausreichend hoher
Sensitivität, die sich als hilfreich bei der indirekten Quantifizierung der
Zellselekti- vität P2R12-modifizierter Liposomen erwiesen hat. Die
Inkorporation der für die Xe-MRT notwendigen Kryptophan-Struktur (CrA) in
Liposomen erfolgte mittels Extrusion. So war es möglich, große Mengen des
hydrophoben CrA in einem Trägersystem zu transportieren. Anschließend
erfolgte die Modifizierung des Trägers mit dem Lipopeptid P2R12.
Viabilitätsstudien zeigten zytotoxische Effekte von reinem CrA, welche bei
CrA-beladenen P2R12 Liposomen nicht auftraten. Die Selektivität von CrA-
beladenen P2R12-Liposomen für HBMEC konnte sowohl mittels Fluoreszenz-
basierter Aufnahmestudien als auch mithilfe der Xe-basierten Hyper-CEST MRT
bei einer Zellkonzentration von ca. 1*10^6 Zellen/ml gezeigt werden. Somit
bieten Lipopeptid-modifizierte Liposomen neben der zielgerichteten Aufnahme in
HBMEC die Möglichkeit, die Sensitivität der Hyper-CEST MRT um das 10-fache
zu verbessern.Die gewonnenen Ergebnisse sollen die Grundlage für erste in
vivo Hyper-CEST MRT Studien von Lipopeptid-modifizierten Trägersystemen
bilden. Die zellphysiologischen Eigenschaften von Hirnkapillarendothelzellen,
wie die Überexpression von LDL-Rezeptoren und eine bestimmte Zusammensetzung
der Proteoglykanmatrix, ist auch bei Gliomazellen zu finden. Daher bietet sich
die Lipopeptidmodifizierung von Trägersysteme an, um die Totoxizität von
Zytostatika gegenüber Gliomazellen zu erhöhen. Aufnahmeuntersuchungen von
Lipopeptid-modifizierten PEG-PE-Mizellen zeigten eine verbesserte Aufnahme in
HBMEC gegenüber HAoEC, obwohl diese Mizellen ein leicht negatives
Zetapotential besitzen. Ähnlich der Aufnahme von P2R12-Liposomen
unterschiedlicher Peptidbesetzungsdichte ist die Zellselektivität von P2R12
-PEG-PE-Mizellen für HBMEC unabhängig von der Oberflächenladung des
Trägersystems. Das Arginin-reiche P2R12 vermittelt die höchste Aufnahme von
PEG-PE-Mizellen in Gliomazellen. Mit Paclitaxel (PCL) beladene Lipopeptid-PEG-
Mizellen zeigen eine ca. 10 % höhere Zytotoxizität gegenüber
Glioblastomazellen im Vergleich zu unmodifizierten PCL-PEG-PE-Mizellen. Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung von Vektorpeptiden, wie dem P2R12, zur
Adressierung von Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke, sowie von Gliomazellen
geeignet ist. Die präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Lipopeptide
vielversprechende Vektoren für eine zielgerichtete Ansteuerung von
Hirnkapillarendothelzellen und Gliomazellen sind. Speziell oligo-Arginin
Peptide zeigen zellselektive Eigenschaften unabhängig von der Größe und der
Peptidbesetzungsdichte der hier untersuchten Trägersysteme. Die Mo-
difikation anderer Trägersysteme, wie z.B. Polymerpartikel oder Lipid-
Nanopartikel, ist je nach Anwendungsgebiet denkbar und bietet die
Möglichkeit, die vielversprechenden Eigenschaften der Lipopeptide weiter zu
studieren und zu optimieren.
de
dc.description.abstract
Lipopeptides and lipopeptide-modified carrier systems were generated according
to the parent peptide P2A2. Covalent coupling of two palmitoyl chains (P2) at
the N-terminus of the peptide sequence provides the basis for generating
peptide based nanoparticulate structures. Like P2A2 synthesized poly-arginine
(P2R12), poly-lysine (P2K12) and poly-glutamic acid (P2E12) peptides were
found to self associate into micelles in a low micromolar concentrations.
Furthermore, the palmitoylation provides stable anchoring in the lipid bilayer
of liposomes and in PEG-PE micelles. The size of lipopeptide micelles was
10-15 nm and their surface potential correlates with the charge properties of
the peptide sequence. PEG chains are known to mask charge properties of
carrier systems and therefore all lipopeptide-modified PEG-PE micelles showed
a slightly negative zeta potential comparable to peptide-free structures.
Besides peptide micelles, small (25 nm) and large (100 nm) lipopeptide-
modified liposomes were prepared. With different molar peptide-to-lipid ratios
the zeta potential changes with respect to the charge characteristics of the
peptide sequence. It was shown that P2R12, P2K12 und P2E12 did not alter the
integrity of the POPC-layer of liposomes. The formation of an amphipathic
α-Helix, as it was observed for P2A2, leads to perturbation of the lipid
bilayer. Uptake studies of lipopeptide-modified nanoparticles were performed
with brain capillary endothelial cells (HBMEC) and aortic endothelial cells
(HAoEC). The lipopeptide-micelles and -liposomes showed no cytotoxicity up to
a concentration of 5 μM. Furthermore, no cytotoxic effects of P2R12-liposomes
were found after an incubation time of 4 h. The uptake studies showed
different interaction patterns depending on the peptide sequence, peptide
surface density and size of the carrier system. Peptide-micelles showed
pronounced interaction with cells. Notwithstanding, that only P2A2 and P2R12
micelles showed an improved uptake into HBMEC compared to HAoEC, solely
P2R12-modified liposomes showed selectivity for brain endothelial cells.
Hence, the uptake-mediating effect of P2R12 is independent of the peptide
surface density and the size of the carrier systems. However, for P2A2 a high
peptide density and high flexibility of the peptide moiety are prerequisite
properties for a pronounced uptake in HBMEC compared to HAoEC. P2A2 micelles
and P2R12 systems were internalized via clathrin-mediated endocytosis. This
results point to an uptake after binding to cell surface-standing
proteoglycans. Additionally, proteglycans are suggested binding partners of
the structurally related TAT peptide. Furthermore, a high expression level of
proteoglycans, especially syndecan-2, was found in brain endothelial cells.
Hence, proteoglycans are considered to be one of the major binding partners of
arginine-rich lipopeptide systems. Xe-based Hyper-CEST MRI is a noninvasive
method with high sensitivity for an indirect quantification of the cell
selectivity of P2R12-modified liposomes. The biosensor Cryptophan (CrA), which
is necessary for Xe Hyper-CEST MRI, was incorporated into liposomes via the
simple extrusion method. This method allows to incorporate and transport large
amounts of CrA. Afterwards, CrA-bearing liposomes were modified with P2R12.
Viability studies showed cytotoxic effects of CrA alone, which were not
observed with CrA-loaded P2R12-liposomes. The cell selectivity of P2R12-CrA-
liposomes was confirmed by fluorescence-based and Xe-based Hyper-CEST MRI
uptake studies. Xe Hyper-CEST MRI studies were perfor- med with a HBMEC
concentration of about 1*10^6 cells/ml. Hence, in addition to the selective
targeting properties of lipopeptide-modified liposomes, the sensitivity of
Hyper-CEST MRI could be improved by at least one order of magnitude compared
to other studies. The results obtained Hyper-CEST MRI studies with
lipopeptide-modified carrier systems provide the basis for future in vivo
studies. Cell physiological properties of brain capillary endothelial cells,
such as the up regulation of LDL receptors and a specific composition of the
proteoglycan matrix were also found in glioma cells. Therefore, the surface
modification of existing carrier systems could lead to an improved
cytotoxicity against glioma cells. Uptake studies of lipopeptide-PEG-PE
micelles showed improved internalization in HBMEC compared to HAoEC, although
these micelles have a slightly negative zeta potential. The cell selectivity
of P2R12-micelles is independent of the peptide surface density, as it was
found for P2R12-modified liposomes. The arginine-rich P2R12 showed the highest
uptake-mediating efficiency for modified PEG-PE micelles in glioma cells.
Paclitaxel (PCL)-loaded lipopeptide-PEG micelles revealed an 10% higher
cytotoxicity in glioblastoma cells compared to unmodified PCL PEG-PE micelles.
P2R12 PEG-PE micelles without paclitaxel had no cytotoxic effect. This studies
demonstrate that vector peptide, such as the P2R12, are promising candidates
targeting endothelial cells of the blood-brain barrier and glioma cells. In
summary, lipopeptides were found to be promising vectors targeting brain
capillary endothelial cells and glioma cells. Especially oligo-arginine
peptides showed cell selectivity independent of the size of the carrier system
or the peptide surface density. The modification of other carrier systems,
such as polymer particles or solid lipid nanoparticles seems to be possible
and will help to understand and optimize the promising properties of
lipopeptides.
en
dc.format.extent
X, 142 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
blood-brain barrier
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Lipopeptid-modifizierte Trägersysteme
dc.contributor.contact
karlsydow@gmail.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Rainer H. Müller
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Matthias F. Melzig
dc.date.accepted
2014-11-25
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000098270-5
dc.title.subtitle
Untersuchungen zur Internalisierung in Hirnkapillarendothel- und Gliomazellen
dc.title.translated
Lipopeptide-modified carrier systems
en
dc.title.translatedsubtitle
uptake studies into blood-brain barrier cells and glioma cells
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000098270
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open access