Proteomics reveal insights into TRPV1 function

Abstract

Transient receptor potential (TRP) ion channels are important components of the somatosensory system, where they are involved in the detection of pain and temperature stimuli. Particularly, the capsaicin receptor TRPV1 plays a crucial role in the perception, transduction and modulation of thermal and inflammatory stimuli. By analogy to the first identified member of the TRP ion channel family in Drosophila, there is emerging evidence that mammalian TRP channels do not function as individual entities but rather depend on additional proteins that are necessary for their specific regulation and modulation. Thus far, protein networks involving TRPV1 have not been sufficiently characterized. Therefore, this PhD work established a genetic and biochemical strategy to isolate TRPV1 protein complexes from transgenic mice expressing a tagged version of the receptor. Using high-resolution mass spectrometry, this work identified two putative interaction partners of TRPV1: the GABAB receptor from affinity purifications of the DRG and Vglut2 from sciatic nerve purifications. TRPV1 showed overlapping distribution with both proteins in DRG neurons and the superficial layers of the dorsal horn of the spinal cord. A physical interaction was demonstrated by co-immunoprecipitation studies in sensory tissue preparations and heterologous cell systems. Functionally, GABAB receptor activation was found to modulate TRPV1 sensitization in vitro and in vivo without affecting TRPV1 activity acutely. The specific GABAB agonist baclofen, reduced NGF-, bradykinin- and serotonin- induced sensitization of TRPV1 in cultured DRG neurons and at the level of the whole animal. In behavioral tests, thermal hyperalgesia was significantly decreased in mice co-injected with baclofen. This observation was absent in TRPV1 knockout animals. Thus, these data suggest that GABAB activation may result in modulation of the PLC/PKC signaling pathway, which is the common downstream signaling pathway of the three inflammatory substances tested. Interestingly, baclofen had no effect on prostaglandin-evoked thermal hyperalgesia, which is mainly mediated by activation of the cAMP/PKA pathway. In conclusion, the results highlight the contribution of GABAB receptors to peripheral analgesia and may provide a novel strategy to interfere with TRPV1 sensitization during inflammatory pain. The detailed mechanism underlying the observed effect has to still be elucidated. Mass spectrometry analysis also identified Vglut2 as a candidate protein. Analysis of the interaction between TRPV1 and Vglut2 demonstrated that a fraction of TRPV1 might be present on a Vglut2-containing vesicular pool as shown by subcellular fractionation of the spinal cord and immunoisolations of Vglut2 - and TRPV1-containing synaptic vesicles. The question of whether TRPV1 plays a role in loading vesicles with glutamate was addressed but did not provide conclusive results. Thus, there remain unsolved questions about the presence and function of TRPV1 channels in synaptic vesicles. Further work is needed to understand its functional association with Vglut2 and putative contribution to glutamatergic synaptic transmission.

Rezeptoren der TRP (Transient Receptor Potential) Familie von Ionenkanälen spielen eine zentrale Rolle bei der Reizwahrnehmung und Reizweiterleitung im somatosensorischen Nervensystem. Insbesondere das Familienmitglied TRPV1 nimmt eine bedeutende Funktion in der Schmerz- und Temperaturwahrnehmung ein. Analog zu den TRP Kanälen in der Phototransduktionskaskade von Drosophila geht man davon aus, dass TRP Kanalproteine bei Säugern Komponenten eines Multiprotein- Komplexes sind, die nur innerhalb diesem spezifisch und effizient funktionieren. Proteine, die mit TRPV1 spezifisch in einem Komplex assoziiert sind, sind noch nicht ausreichend charakterisiert worden. Ziel der Doktorarbeit war daher die Isolierung und Untersuchung von TRPV1 Proteinkomplexen in Mäusen, um die Funktionsweise des Rezeptors besser zu verstehen. Dazu wurde eine Proteomik-Methode entwickelt, die ermöglichte, den Rezeptor aus nativem sensorischen Gewebe transgener Mäuse zu isolieren. Durch massenspektrometrische Analyse von TRPV1-Aufreinigungen aus den DRG und dem Ischias-Nerv konnten spezifisch und signifikant angereicherte Proteine identifiziert werden. Zwei Proteine, GABAB1a und Vglut2, wurden ausgewählt, um ihre Bedeutung für die Funktionsweise von TRPV1 mittels Expressions- und biochemischen Analysen sowie funktionellen Studien zu verdeutlichen. TRPV1 kolokalisierte mit dem GABAB Rezeptor in DRG Neuronen und in den Laminae I und II im dorsalen Rückenmark. Eine physische Interaktion wurde durch Ko- Immunopräzipitation in DRG Neuronen sowie heterologen Zell Expressionssystemen gezeigt. Auf funktioneller Ebene reduzierte der spezifische GABAB Agonist, Baclofen, die Sensitivierung von TRPV1 nach Applikation inflammatorischer Substanzen wie NGF, Bradykinin und Serotonin in vitro und in vivo, während Baclofen keinen Effekt auf akute Aktivierung von TRPV1 hatte. In Verhaltensexperimenten verminderte Baclofen die Entstehung von NGF-, Bradykinin- und Serotonin-induzierter thermaler Hypersensibilität. Diese Ergebnisse zeigen, dass GABAB Aktivierung möglicherweise die PLC/PKC- Signalkaskade moduliert, welche den drei inflammatorischen Substanzen zugrunde liegt, und damit die Sensitivierung von TRPV1 inhibiert. Interessanterweise konnte der schmerzlindernde Effekt nicht nach Prostaglandin-induzierter thermaler Hyperalgesie beobachtet werden, welche auf Aktivierung des cAMP/PKA- Signalwegs basiert. In Folgeexperimenten muss noch untersucht werden, welcher Mechanismus der Inhibition der TRPV1 Sensitivierung durch Baclofen zugrunde liegt. Zusammenfassend unterstreichen die Ergebnisse die Funktion von GABAB Rezeptoren im peripheren Nervensystem und heben zusätzlich GABAB Rezeptoren als potentielle Kandidaten für die Schmerztherapie hervor. Die massenspektrometrische Analyse von TRPV1-Aufreinigungen aus dem Ischias-Nerv identifizierte Vglut2 als potentiellen Interaktionspartner. Die Charakterisierung der Assoziation von TRPV1 und Vglut2 zeigte, dass beide Proteine in DRG Neuronen, im dorsalen Rückenmark sowie in transfizierten F11 Zellen kolokalisieren. Des Weiteren wurde mittels subzellulärer Fraktionierung des Rückenmarks und Immunoisolationen ersichtlich, dass eine Subpopulation von TRPV1 Molekülen in Vglut2 positiven synaptischen Vesikeln enthalten ist. Die Funktion des Rezeptors auf diesen Vesikeln wurde durch Glutamat-Uptake- Experimente versucht zu erörtern, führte jedoch zu keinem Ergebnis. Somit bleibt die Frage nach einer Funktion offen. Zukünftige Experimente müssen zeigen, ob und wie TRPV1 und Vglut2 funktionell assoziiert sind und welche Rolle TRPV1 in der glutamatergen synaptischen Transmission einnimmt.