TP53-abhängige DNA-Reparatur- und Regulationsmechanismen im klassischen Hodgkin-Lymphom und B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen

Abstract

Eine Blockierung der Apoptose, eine Fehlregulation des Zellzyklus mit gestörten Mitosen und eine Überexpression des TP53-Proteins in den Hodgkin- und Reed-Sternberg-Zellen (HRS-Zellen) des klassischen Hodgkin-Lymphoms (cHL) lassen einen defekten P53-Signalweg vermuten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Defekte im P53-Signalweg der HRS-Zellen aufzudecken. Dazu wurden cHL-Zelllinien und vergleichend verschiedene B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom- Zelllinien (B-NHL) untersucht. In diesen erfolgte eine Mutationsanalyse der gesamten kodierenden Region des TP53-Gens. Weiterhin wurde die Funktionalität des TP53-Proteins überprüft. Dafür wurden die Zelllinien ionisierener Strahlung ausgesetzt. Die Strahlung verursacht DNA-Schäden, die unter physiologischen Bedingungen zur Induktion des P53-Signalwegs und damit zu einer Aktivierung und Zunahme des TP53-Proteins führen. Aktiviertes TP53-Protein mit intakter Funktion bewirkt eine Expressionsänderung der TP53-Zielgene wie z.B. die Induktion von P21. Somit dient das P21-Protein als Marker der TP53-Funktion. Mittels Westernblot wurde die Proteinexpression von TP53 und P21 vor und nach der Bestrahlung der Zelllinien bestimmt. Um weitere Pathomechanismen zu identifizieren, die nicht auf Mutationen im TP53-Gen oder auf Funktionsstörungen des TP53-Proteins selbst basieren, wurden genomweite RNA-Expressionsanalysen (GeneChip) durchgeführt. Diese Arbeit zeigt, dass TP53 in verschiedenen Lymphomentitäten nicht funktional ist und dadurch zur Pathogenese dieser Erkrankungen beitragen kann. Insbesondere beim cHL finden sich bisher unbekannte TP53-Mutationen in Genregionen, die außerhalb der bekannten Mutations-hotspots liegen. Die Aberrationen im TP53-Gen der untersuchten cHL-Zelllinien führen zu trunkierten und in ihrer Funktion gestörten TP53-Proteinen. Die strahlungsinduzierte Aktivierung des P53-Signalwegs zeigte daher in keiner cHL-Zelllinie eine adäquate Expressionszunahme des TP53- und des P21-Proteins. Als Folge der gestörten TP53-Funktion finden sich eine mangelnde Induktion von TP53-Zielgenen und deregulierte TP53-assoziierte Apoptose- und Zellzyklus-Signalwege. Dies zeigte sich z.B. in der Genexpressionszunahme von proliferationsfördernden Zyklinen (Zyklin D2; Zyklin L1) und in der Deregulation der apoptose-regulierenden BCL-2-Familienmitglieder. Zudem fanden sich Fehlregulationen von Genen, wie die Expressionszunahme der TP53-Inhibitoren BCL2A1 und JUN-D, die sich zusätzlich zu den TP53-Defekten negativ auf die Regulation des TP53-Gens/TP53-Proteins auswirken können. Aufgrund dieser Ergebnisse ist von einer schweren bzw. kompletten TP53-Störung mit Beeinträchtigung von Zellzyklus, DNA-Reparatur und Apoptose beim cHL auszugehen. Diese Beobachtungen passen sehr gut zu den Befunden beim cHL, die eine massive Störung der DNA-Reparaturmechanismen dieser Erkrankung postulieren. Die Untersuchungen der Zelllinien vom diffusen großzelligen B-NHL (DLBCL) ergaben für den molekularen ABC-Typ (Ly-3; Ly-10) das Vorliegen eines funktionsfähigen TP53-Proteins bei intaktem P53-Signalweg. Dagegen wies die DLBCL-Zelllinie vom GCB-Typ (SU-DHL-4) einen defekten P53-Signalweg mit einer Mutation des TP53-Gens in der DNA-Bindungsdomäne und einem funktionslosen TP53-Protein auf. Dies deutet darauf hin, dass Mutationen des TP53-Gens und Störungen der TP53-Proteinfunktion eine Rolle beim DLBCL vom GCB-Typ spielen können. In der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL)-Zelllinie EHEB liegt ebenfalls ein defekter P53-Signalweg mit massiven Störungen in der Regulation von Zellzyklus und Apoptose vor. Durch die strahlungsbedingte TP53-Aktivierung wurde kein einziges TP53-Zielgen, kein proapoptotisches Gen und nur zwei Zellzyklusarrest vermittelnde Gene induziert. Im TP53-Gen wurden keine Veränderungen gefunden, die dies erklären. Insgesamt finden sich zwischen den cHL- und den B-NHL- Zelllinien weder in der Mutationsanalyse des TP53-Gens Gemeinsamkeiten, noch zeigen sich in der Regulation des durch Zellbestrahlung aktivierten P53-Signalwegs Ähnlichkeiten zwischen den beiden Lymphomentitäten.

Failure of apoptosis, disturbance of cell cycle with disrupted mitosis and overexpression of the tumor suppressor protein TP53 suggest a disturbed P53-pathway in Hodgkin- and Reed-Sternberg-(HRS) cells of classical Hodgkin Lymphoma (cHL). The aim of the present study was to further dissect the impairments within the P53-signaling. For this purpose cHL cell lines and - for comparison - several B-cell non-Hodgkin Lymphoma (B-NHL) cell lines were investigated. In order to examine the functionality of the TP53 protein the cell lines were exposed to ionizing radiation (IR). IR causes DNA damages, which induce the P53-pathway and activate and increase the TP53 protein under physiological conditions. Consequently the gene expression levels of TP53 target genes are changed. One of the most important target genes is P21 and therefore the P21 expression was used as a marker of TP53 functionality. Protein expression of TP53 and P21 were assessed by Western blotting before and after IR. To evaluate further TP53 dependent pathomechanisms genome wide gene expression analyses (Affymetrix GeneChips) were conducted. In addition mutation analysis of the entire coding region of the TP53 gene was performed. Our experiments showed that TP53 is not functional in several of the analyzed cell lines representing different lymphoma entities and therefore may influence the pathogenesis of these diseases. Particularly in cHL cell lines we found new TP53 gene mutations outside the common hot spot regions leading to truncated and defective TP53 proteins. The activation of the P53-pathway caused by IR did not induce an adequate increase of TP53 and P21 protein expression in any of the cHL cell lines. In consequence inappropriate regulation of TP53 target genes and dysregulation of TP53 dependent apoptosis and cell cycle pathways was detected. This led to an inadequate increase of gene expression of proliferative genes e.g. cyclines and dysregulation of BCL-2 family members. Furthermore we found a pathological increase of gene expression of the TP53 inhibitors BCL2A1 and JUND, which may additionally impair the TP53 regulation. The comparison group of B-NHL cell lines showed diverse results. Whereas analysis of diffuse large cell B-NHL (DLBLC) cell lines of ABC subtype (Ly-3; Ly-10) demonstrated an intact TP53 protein and a functional P53-pathway, DLBCL cell lines of GCB subtype had a disturbed P53-pathway with TP53 gene mutations within the DNA binding domain and a dysfunctional TP53 protein. This implicates that TP53 gene mutation and dysfunctional TP53 protein might be important for the pathogenesis of the DLBCL GCB subtype. The chronic lymphatic leukemia (CLL) cell line also displayed a disrupted P53 pathway with strong dysregulation of apoptosis and cell cycle. None of the TP53 target genes or apoptosis-related genes and only two cell cycle arrest genes were induced by radiation caused TP53 activation. However we found no according aberrations in the TP53 gene. In summary these results indicate a strong TP53 disturbance with impaired cell cycle, apoptosis and DNA repair in cHL according to published data that postulate severe dysfunction of DNA repair in this disease. In respect to the mutations detected in the TP53 gene and the dysregulation of the P53-pathway we found no similarities between cHL and B-NHL cell lines, indicating different mechanisms of pathogenesis in the different lymphoma entities.