Synthese, Charakterisierung und Wechselwirkung definierter Nanopartikel mit biologischen Systemen

Abstract

Der Marktanteil von kommerziell erhältlichen Produkten, die Nanopartikel enthalten, z.B. Sonnencremes, Zahnpasten, Textilien, Nuckel, Babyflaschen etc., ist in den letzten Jahren rasant angestiegen. Da die Auswirkungen von Nanopartikeln auf den menschlichen Organismus nicht abgeschätzt werden können, ist die Erfor-schung dieser Wechselwirkung von großem gesellschaftlichem Interesse. Im Rah-men dieser Arbeit wurden offene Fragestellungen zur Bildung und Auflösung von Nanopartikeln und zur Wechselwirkung von Nanomaterialien mit humanen Zellen und humaner Haut diskutiert und beantwortet. Die drei grundlegenden Motivationen waren: erstens, die Erforschung, welche Nanopartikelmaterialien mit verschiedenen Oberflächenfunktionalisierungen bevorzugt in den Zellkern eindringen, zweitens, welche Nanopartikelform bevorzugt von verschiedenen Zellen aufgenommen wer-den, und drittens, in welche Schichten Nanopartikel der nativen und nicht-nativen Humanhaut penetrieren. Im Folgenden werden die erzielten Ergebnisse kurz prä-sentiert: Der Zellkern ist die wichtigste subzelluläre Einheit, in der unter anderem die Dupli-zierung der DNA stattfindet. Mittels Cryo- Röntgenmikroskopie/-tomographie und Transmissionselektronenmikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass Goldna-nopartikel mit Citrat-Funktionalisierung mit einem Durchmesser von (60±5) nm im Verhältnis zu Silicananopartikeln mit einem Durchmesser von (51±2) nm und Gold-nanopartikeln mit Silicaschale mit einem Durchmesser von (68±8) nm in den Zell-kern humaner Keratinozyten aufgenommen werden. Zudem führten Citrat-funktionalisierte Goldnanopartikel zu einer stärkeren Verminderung der Viabilität der Zellen im Vergleich zu Nanopartikeln mit Silanolatoberfläche (Silicananopartikel und Goldnanopartikel mit Silicaschale). Silbernanopartikel werden aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften in zahl-reichen Konsumprodukten eingesetzt, sodass eine intensive Wechselwirkung mit Menschen nicht ausgeschlossen werden kann. Silbernanopartikel sind bekannt für zytotoxische Effekte, die auf der Freisetzung von Silberionen in wässrigen Syste-men beruhen. Mittels UV/VIS- Spektroskopie, Elektronenmikroskopie und Atomab-sorptionsspektrometrie wurde die Auflösung von trigonalen Silbernanoprismen mit der Auflösung ihrer sphärischen Analoga in verschiedenen Medien verglichen. Da-bei zeigte sich, dass Medien, die vergleichbar zum Zytoplasma sind, z.B. isotonische Kochsalzlösung (pH 7) und isotonischer Acetatpuffer (pH 4) im Verhältnis zu Reinstwasser (pH 7) oder Acetatpuffer (pH 4), die trigonalen Silbernanoprismen am stärksten anlösten. Sphärische Analoga wurden in diesen Medien stärker angelöst als trigonal-prismatische Silbernanopartikel. Anschließend wurde die formabhängige Aufnahme von Silbernanopartikeln in hu-mane Stammzellen und humane Keratinozyten untersucht. Mittels Atomabsorpti-onsspektrometrie und Transmissionselektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass trigonale Silbernanoprismen in deutlich höherer Quantität von Stammzellen aufgenommen wurden, während sphärische Silbernanopartikel in höherer Quanti-tät von Keratinozyten aufgenommen wurden. Dieser Effekt wird der geringeren Bie- gesteifigkeit von humanen Stammzellen im Vergleich zu Keratinozyten zugespro- chen. Aufgrund der erhöhten Elastizität kann es zu einer Vergrößerung der Adhä-sionsenergie der trigonalen Prismen kommen, da die Verformung der Membran we-niger Energie bedarf. In der Transmissionselektronenmikroskopie zeigte sich, dass sphärische Silbernanopartikel innerhalb von Zellen deutlich dichtere Aggregate bil-deten als trigonale Silbernanoprismen. Mittels Rastertransmissionsröntgenmikro-skopie konnten nur wenige trigonale Silbernanoprismen, aber zahlreiche Silber-sphären in humanen Keratinozyten und Stammzellen nachgewiesen werden. Die-se vermutete, unterschiedlich starke Aufnahme lässt sich durch die erhöhte Auflö-sung der trigonalen Silbernanoprismen im Verhältnis zu sphärischen Analoga in-nerhalb der Zelle erklären. Schließlich waren trigonale Silbernanoprismen mit einer ursprünglichen Kantenlänge von (42±15) nm und einer Prismendicke von (8±1) nm nach 24 h innerhalb der Zelle stark angelöst und haben einen Durchmesser von (7±4) nm. Die sphärischen Nanopartikel mit einem ursprünglichen Durchmesser von (70±25) nm wurden ebenfalls deutlich angelöst und haben einen Durchmesser von (13±7) nm, sie bildeten allerdings verstärkt dicht gepackte Agglomerate in den Zellen. Somit konnten mittels Rastertransmissionsröntgenmikroskopie (Auflösung < 40 nm) die trigonalen Silbernanoprismen nicht nachgewiesen werden, während die deutlich dichter gepackten und größeren Silbersphären nachgewiesen werden konnten. Die Untersuchung der Aufnahme von Nanopartikeln in humane Haut ist ebenfalls von großem gesellschaftlichen Interesse, da vermutet wird, dass die Haut neben dem Darm und der Lunge die Haupteingangsroute für Nanopartikel ist. Mit Silica-nanopartikeln inkubierte, exzidierte humane Haut wurde mittels Transmissionselekt-ronenmikroskopie untersucht. Ein Nachteil dieser Analysetechnik ist, dass die Pro-ben zunächst mit Glutaraldehyd und Paraformaldehyd fixiert und mit Ethanol ent-wässert werden. Bei diesem Waschprozess ist es möglich, dass Nanopartikel aus der Haut gewaschen werden. Daher wurden Silicananopartikel mit einem Durch-messer von (55±6) nm aminofunktionalisiert und die Quervernetzung mit den zur Fixierung verwendeten Aldehyden mittels dynamischer Lichtstreuung nachgewie-sen, sodass davon ausgegangen werden konnte, dass in der Haut die Auswa-schung der Nanopartikel minimiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass in nicht- gestörter Haut keine Nanopartikel aufgenommen wurden. In Haut deren Barriere gestört ist, konnte nachgewiesen werden, dass aminofunktionalisierte Nanopartikel in der obersten Schicht der Haut, dem Stratum corneum und in darunter liegenden Hautschichten sowie innerhalb der Dermis gefunden werden konnten. Innerhalb der Dermis waren die aminofunktionalisierten Silicananopartikel sehr nahe an ein Strukturproteins (Kollagen) lokalisiert. Hierdurch kann eine Beeinträchtigung des Kollagens nicht ausgeschlossen werden.

The market share of commercially available products containing nanoparticles, e.g. sun creams, toothpastes, textiles, pacifier, baby bottles, etc., has increased rapidly in recent years. Since the effects of nanoparticles on the human body cannot be esti-mated, research on this interaction is of great public interest. As part of this work, open questions concerning the formation and dissolution of nanoparticles and the interaction of nanomaterials with human cells and human skin were discussed and answered. The three basic motivations were: firstly, what nanoparticle materials with various surface modifications penetrate preferably in the cell nucleus, secondly, what nanoparticle shape is preferentially taken up by different cell types, and thirdly, in which layers of human skin can nanoparticles penetrate, where native and non-native skin samples investigated. In the following, the major results obtained from this work are presented: The nucleus is the most important subcellular unit in which duplication of DNA takes place. Cryo-X-ray microscopy/tomography and transmission electron micros-copy studies indicate that gold nanoparticles with citrate-functionalization with a di-ameter of (60±5) nm were taken up by the nucleus of human keratinocytes. This is not observed for silica nanoparticles with a diameter of (51±2) nm and gold nanopar-ticles with a silica shell with a diameter of (68±8) nm. In addition, the uptake of cit-rate-functionalized gold nanoparticles led to a reduction of the cell viability, as com-pared to the uptake of nanoparticles with a silanolate surface (silica nanoparticles and gold nanoparticles with silica shell). Silver nanoparticles are used for their antimicrobial properties in numerous con-sumer products, so that the intense interaction with humans cannot be excluded. Silver nanoparticles are known for cytotoxic effects, which rely on the release of sil-ver ions in aqueous media. Results from UV /VIS-spectroscopy, electron microscopy, and atomic absorption spectrometry are reported, where the dissolution of trigonal silver nanoprisms was compared to the dissolution of their spherical analogues in various media. It was found, that trigonal silver nanoprisms were strongest dissolved in media which are comparable to the cytoplasm, for example, isotonic saline (pH 7) and isotonic acetate buffer (pH 4), which is different from ultrapure water (pH 7) or acetate buffer (pH 4). Spherical analogues dissolved significantly stronger in these media compared to trigonal prismatic silver nanoparticles. Subsequently, the shape-dependent uptake of silver nanoparticles in human stem cells and human keratinocytes was investigated. By means of atomic absorption spectrometry and transmission electron microscopy it could be shown that trigonal silver nanoprisms were taken up by stem cells in significantly higher quantity, whereas spherical silver nanoparticles were taken up in keratinocytes in higher quantity. This effect was attributed to the smaller bending stiffness of human stem cells as compared to keratinocytes. The increased elasticity could lead to a higher adhesion energy of the trigonal prisms, since the deformation of the membrane re-quires less energy. Transmission electron microscopy studies indicate that spherical silver nanoparticles form within cells significantly denser aggregates than trigonal silver nanoprisms. With scanning transmission X-ray microscopy few trigonal silver nanoprisms, but numerous silver spheres could be detected in human keratinocytes and stem cells. This implies that different uptake properties could be explained by the increased dissolution of the trigonal silver nanoprisms in relation to spherical analogues within cells. Finally, trigonal silver nanoprisms with an initial edge length of (42±15) nm and a thickness of (8±1) nm were investigated. It is shown that the uptaken particles were highly dissolved and had after 24 h a diameter of (7±4) nm. The spherical nanoparticles with an initial diameter of (70±25) nm were also signifi-cantly dissolved and had a final diameter of (13±7) nm after 24 h. Particles resulting from shrinking processes of the originally spherical silver nanoparticles tended to form more dense and aggregated structures inside lysosomes and endosomes than those resulting from triangular prisms. This enabled the detection of trigonal silver nanoprisms by scanning transmission X-ray microscopy (resolution <40 nm), so that the much larger and more densely packed silver spheres could be detected. Studies on the uptake of nanoparticles into human skin is also of great public inter-est since skin is assumed to be the main entry route for nanoparticles besides the intestine and lung. Excised human skin that has been incubated with silica nano-particles was studied by transmission electron microscopy. One disadvantage of this analysis technique is that the samples are fixed with glutaraldehyde and paraform-aldehyde and dehydrated with ethanol. In this washing process, it is possible that nanoparticles are washed out from the skin. Therefore, the silica nanoparticles with a diameter of (55±6) nm were amino-functionalized. The crosslinking of nanoparti-cles by aldehydes was used for fixing and the success of this process was proved by dynamic light scattering. This implies that washing out of amino-functionalized nanoparticles from the skin has been minimized. Furthermore, it was shown that no nanoparticles were taken up by non-damaged skin. In skin barrier disrupted skin, however, it could be shown that amino-functionalized nanoparticles are found in the uppermost layer of the skin (stratum corneum), deeper epidermal layers, and within the dermis. Within the dermis, the amino-functionalized nanoparticles were localized close to a structural protein (collagen). Therefore degradation of collagen cannot be excluded.