Immunhistochemischer Nachweis der CD44-Spleißvarianten CD44v3, CD44v5, CD44v7 und CD44v10 auf Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich unter Berücksichtigung ihrer quantitativen Verteilung in Abhängigkeit von der Entfernung zum Tumorzentrum

Abstract

Die Feldkanzerisierung und die Disseminierung der Tumorzellen in der Umgebung des Primärtumors spielen für den Krankheitsverlauf der Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich eine wichtige Rolle. Deshalb sucht man nach Invasionsmarkern, um frühzeitig pathologische molekulare Prozesse in der Tumorumgebung erkennen und so rechtzeitig weitere therapeutische Maßnahmen ergreifen zu können. Für die Ausbreitung der Plattenepithelkarzinome im Kopf- Hals-Bereich sind multiple Faktoren bestimmend, dabei auch das Adhäsionsmolekül CD44. Deshalb befassen sich die Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit mit der Frage, welche Bedeutung der Nachweis der Spleißvarianten CD44v3, CD44v5, CD44v7 und CD44v10 für Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich hat. Der immunhistochemische Nachweis der Expression der vier Spleißvarianten in den Geweben der Tumor- und Kontrollpatienten erfolgte mit der APAAP-Methode. Hauptsächlich konnten wir dafür Gefrierschnitte herstellen und einsetzen. Bei einem geringeren Teil der Gewebe der Tumorpatienten (10%) stand uns nur formalinfixiertes Material für Paraffinschnitte zur Verfügung. Die Expression der vier Spleißvarianten wurde semiquantitativ durch Scorewerte ermittelt, dabei wurde aus dem Färbeindex (SI) und dem prozentualen Anteil positiver Zellen (PP) ein immunreaktiver Scorewert (IRS = SI x PP) berechnet. Da es uns darauf ankam, auch die Tumorumgebung in diese Studie einzubeziehen, untersuchten wir Tumorzentrumgewebe, Tumorrandgewebe und tumorferne Gewebe von 20 Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich und verglichen die Expression in den einzelnen Gewebebereichen untereinander sowie mit 20 Kontrollgeweben aus vergleichbaren Lokalisationen des Kopf-Hals-Bereiches. Weiterhin untersuchten wir die Expression der vier CD44-Spleißvarianten im Bindegewebe, im lymphatischen Gewebe bzw. in lymphozytären Infiltraten, auf Drüsengeweben, in der Muskulatur, auf Endothelien sowie auf Nervengewebe. Auf allen Karzinomen des Tumorzentrums oder Tumorrandbereichs wiesen wir eine Antigenexpression von CD44v3 und CD44v5 nach. Mehr als 70% dieser Karzinome zeigten auch eine Expression von CD44v7 und mehr als 86% eine CD44v10-Expression. Auf dem nicht entarteten Plattenepithel (neben dem Karzinom im Tumorzentrum und / oder Tumorrand sowie im tumorfernen Gewebe) waren mit wenigen Ausnahmen immer alle untersuchten CD44-Spleißvarianten nachzuweisen. Auf den Geweben der Kontrollpatienten wiesen wir auf allen Epithelien CD44v3 und CD44v5 nach, auf 89% der Epithelien CD44v7 und auf 94% der Epithelien CD44v10. Bindegewebe zeigte mit unseren CD44-Antikörpern keine Anfärbung. Tonsilläres lymphatisches Gewebe bzw. lymphozytäre Infiltrate zeigten in wenigen Präparaten eine Expression von CD44v3, CD44v5 oder CD44v10. Muskelgewebe war auf den Paraffinschnitten mit Anti-CD44v3 und Anti-CD44v5 unspezifisch angefärbt. Nervengewebe zeigte auf Kryostatschnitten eine Anfärbung mit Anti-CD44v10. Auf Gefäßendothelien, vor allem auf Paraffinschnitten, wiesen wir eine Expression von CD44v3 und CD44v5 nach, vereinzelt auch von CD44v10. Die Gefäßendothelien auf den Gefrierschnitten der Kontrollgewebe zeigten in keinem Fall eine Expression der untersuchten 4 CD44-Spleißvarianten. Alle Drüsengewebe (Paraffin- und Kryostatschnitte) in den Geweben der Karzinompatienten reagierten mit den 4 untersuchten Anti- CD44-Antikörpern. Dagegen zeigte das Drüsengewebe in den Kontrollgeweben nur eine Expression von CD44v3 und CD44v5. Die Expression der einzelnen CD44-Spleißvarianten unterschied sich nicht signifikant in den drei untersuchten Gewebelokalisationen (Tumorzentrum, Tumorrand, tumorfernes Gewebe). Die Expression von CD44v10 auf dem tumorfernen Plattenepithel war signifikant abhängig vom Tumorgrading. Ansonsten war die Expression der CD44-Spleißvarianten auf den Geweben mit einem unterschiedlichen Tumorgrading oder Tumorstaging nicht signifikant verschieden. Für die Ermittlung eines geeigneten diagnostischen und / oder therapeutischen Markers interessierte vor allem, welche der vier CD44-Spleißvarianten auf den in dieser Arbeit untersuchten Geweben, vor allem auf den Karzinomen und den Plattenepithelien, am stärksten exprimiert war. An unseren Ergebnisstabellen erkennt man, dass die Expression von CD44v5 deutlich höher als die Expression der anderen drei Spleißvarianten war. Weiterhin unterschied sich die nur gering nachweisbare Expression von CD44v10 signifikant von der Expression der drei anderen Spleißvarianten: An unseren Patientengeweben konnten wir nur eine intrazelluläre Expression von CD44v10 nachweisen, während die anderen Spleißvarianten ausschliesslich auf der Zellmembran lokalisiert waren. Da wir seit der Gewebeentnahme mehrere Jahre den weiteren Krankheitsverlauf der Patienten durch die Tumornachsorge in unserer Klinik verfolgen konnten, überprüften wir in Kaplan-Meier-Kurven eine mögliche prognostische Bedeutung der nachgewiesenen CD44-Expression auf dem Karzinom im Tumorzentrum und im Tumorrand. Nur die Kaplan-Meier-Kurve der Expression von CD44v10 auf den Karzinomgeweben des Tumorzentrums lässt eine prognostische Aussage bezüglich des weiteren Krankheitverlaufes zu: Bei Patienten mit einer fehlenden oder geringen CD44v10-Expression war die rezidivfreie Zeit nahezu signifikant verlängert. Eingeschränkt durch die geringe Fallzahl im Tumorrandbereich sind die Unterschiede der Expression der 4 untersuchten Spleißvarianten dort nur mit Vorsicht zu bewerten. Allerdings weisen die Ergebnisse darauf hin, dass sich eine geringere Expression von CD44v3, CD44v5 und CD44v10 und eine höhere Expression von CD44v7 günstig auf die Prognose auswirkt.

The prognosis of head/neck squamous cell carcinoma depends on field- cancerisation and dissemination of tumourcells near the primary tumour. Distant metastases play a lesser role for prognosis. So the search is on for markers of cancerinvasion, to detect even molecular pathological changes and to be able to start an early therapy. The spreading of head/neck squamous cell carcinoma depends on multiple factors. One of these factors is the adhesion molecul CD44. In this study we examined the meaning of splicevariants CD44v3, CD44v5, CD44v7 und CD44v10 for patients with head/neck squamous cell carcinoma. We used the APAAP-method for the immunhistochemic detection of our 4 splice-variants. 90% of our tissues were kryostatic samples, 10% were paraffin-embeded samples. To compare the expression of our splice-variants, we multiplied the staining intensity of the expression (SI) with the percentage of stained cells (PP) to an immunreactive score (IRS = SI x PP). We studied the expression of our 4 splice-variants in the center and margin of the tumour and in a distant, tumourfree region of 20 patients with head/neck squamous cell carcinoma. We compared the expression of the splice-variants CD44v3, -v5, -v7 and -v10 in these regions with each other and the expression in these regions with the expression on tissue-samples of 20 non-cancer patients from similar regions of the head/neck area. Furthermore we studied the expression of our CD44-splice-variants in connective-, lymphatic-, glandular-, muscular-, endothelial- and nerval tissue. We found the expression of CD44v3 and -v5 on all tumoursamples (tumourcenter and -margin). Over 70% of those samples showed the expression of CD44v7 and over 86% the expression of CD44v10. On the non- neoplastic mucosa (near the carcinoma in the tumorcenter and / or tumour- margin) and the mucosa of the tumour-distant region we found, with small exceptions, always all 4 splice-variants. The expression of CD44v3 and -v5 was detected on all mucosal samples, CD44v7 on 89% and CD44v10 on 94% of the mucosal samples of the control-patients. Connective tissue showed no expression of our 4 splice-variants, lymphatic tissue only in a small number of samples the expression of CD44v3, -v5 and -v10. Muscular tissue on paraffin-embeded samples was unspecificly stained by CD44v3 and -v5. Neural tissue on cryostatic samples could be stained with CD44v10, endothelial tissues, especially on paraffin-embeded samples, with CD44v3 and -v5, occasionally with CD44v10. Endothelial tissues on the cryostatic samples of our control-patients showed no expression of our 4 splice-variants. All four CD44-splice-variants stained the glandular tissue of the tumour-patients, but only CD44v3 and -v5 the glandular tissue of the non-tumour patients. There was no significant difference between the scores of expression of each of our 4 splice-variants, considering the distance to the tumourcenter. The Expression of CD44v10 on the mukosa of the tumour-distant region was significally dependent from tumour-grading. Other scores of expression of our 4 splice- variants were neither dependent from tumourgrading nor from tumourstaging For the detection of an ample diagnostic and / or therapeutic marker was relevant, which CD44-splice-variants expression was the highest, specially on squamous carcinoma and mucosa. The expression of CD44v5 was significantly higher than the expression of the other 3 splice-variants. And there was a significant difference in the expression of CD44v10 and the expression of the other 3 splice-variants. We found CD44v10 only in the cell-nucleus and the other 3 variants only on the cell-membrane. After taking the tissue samples we had a patients follow up over several years. So we could undertake a Kaplan-Meier- analysis for a possible prognostic significance of the examined CD44-expression on the carcinomacells in the tumourcenter and -margin Only the Kaplan-Meier-analysis of the expression of CD44v10 is of prognostic value regarding the further course of disease. In patients with no or lower expression of CD44v10 we found a nearly significant longer recurrence-free time. Restricted by the small number of tissue samples in the tumourmargin we could mark the differences between the expression-scores of our 4 splice- variants there only with caution. But the results of the Kaplan-Meier-analysis seem to suggest, that a lower expression of CD44v3, -v5 and -v10 and a higher expression of CD44v7 is favourably for the patients prognosis.