Analyse der Ror2-Funktionen in vivo und in vitro: die Ror2W749X-Maus als Modell für humane Brachydaktylie Typ B

Abstract

Bei Ror2 (Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2) handelt es sich um einen hochkonservierten Oberflächenrezeptor, welcher vor allem im Zusammenhang mit verschiedenen Wnt-Signalwegen sowie zellulären Vorgängen wie Zellpolarität und Zellmigration beschrieben ist. Beim Menschen resultieren Mutationen in ROR2 in zwei den Skelettapparat betreffenden genetisch bedingten Erkrankungen. Mutationen, die das rezessive Robinow Syndrom verursachen, führen vermutlich über eine ER-vermittelte Degradation zum Funktionsverlust des Proteins. Dagegen trunkieren Mutationen, die sich in dominanter Brachydaktylie Typ B (BDB) äußern, das Protein entweder direkt nach der Membran oder nach der Kinase-Domäne. In beiden Fällen wird der Ror-charakteristische Serin/Threonin /Prolin-reiche C-Terminus abgetrennt und ein Funktionsgewinn des trunkierten Proteins vermutet. Basierend auf der Ror2W749X-Maus, welche die distale menschliche ROR2-Trunkation wiederspiegelt, wurde die Pathogenese der Brachydaktylie (BD) eingehend analysiert. Die Entwicklung des Phänotyps konnte zeitlich auf E13.5 und räumlich auf die Etablierung der distalen Fingerspitze (Phalangen 2 und 3) festgelegt werden. In der Ror2W749X-Maus führen dort Defekte in der Zellproliferation und Zellrekrutierung zu einer nur rudimentär angelegten Knorpelkondensation, welche anschließend zum distalen Fingerelement differenziert. Somit fehlen der homozygoten Ror2W749X-Maus final alle mittleren Phalangen. Dabei resultiert die Trunkation von Ror2 in einem Zusammenbruch des Signalnetzwerkes an der sich entwickelnden Fingerspitze. Ausschlaggebend ist hierbei die lokale Inhibition des Bmp-Signalwegs in der für das proximo-distale Auswachsen essentiellen Region der phalanx forming region (PFR). Die zum Zeitpunkt der Entstehung der mittleren Phalangen blockierte PFR resultiert im Phänotyp der BD. Als wahrscheinliche Ursache konnte ein ektopes kanonisches Wnt-Signal in Kombination mit einer verminderten Ihh-vermittelten Signaltransduktion nachgewiesen werden. In einer ebenfalls durchgeführten Expressionsanalyse aller Wnt-Liganden und ihrer wichtigsten Antagonisten wurden Wnt5a und Wnt5b als potentiell verantwortliche Ror2-Liganden identifiziert. Zusammen mit weiteren in vitro Experimente wurde ein allgemeines Modell der Fingerentwicklung sowie der Ror2-vermittelter Signaltransduktion entwickelt. Neben der Interaktion von Ror2 mit dem Bmp- Antagonisten Noggin konnte die Interaktion von Ror2 mit der zentralen Komponente aller Wnt Signalwege Dishevelled (Dvl) nachgewiesen werden. Dabei interagiert Ror2 in Abhängigkeit von Wnt5a mit der CK1ε-phosphorylierten Form von Dvl (ps-Dvl) und lokalisiert in Punkten nahe der Zellmembran. Auch konnte die funktionelle Relevanz der Ror2/ps-Dvl-Interaktion gezeigt werden. Sie ist an der Termination des Wnt5a/Ror2/ATF2-Signalwegs beteiligt und spielt eine potentielle Rolle bei der Inhibition des kanonischen Wnt-Signalwegs in vivo und in vitro. Da die Interaktion über die Serin/Threonin/Prolin-reiche Domäne von Ror2 stattfindet ist sie ein vielversprechender Kandidat zur Erklärung der BD in der Ror2W749X-Maus und im Menschen. Die in dieser Arbeit erlangten Daten verdeutlichen die zentrale Position von Ror2 im Netzwerk verschiedener Signalkaskaden und unterstreichen vor allem die Rolle von Ror2 als Wnt- Corezeptor, Mediator zwischen Wnt- und Bmp-Signaltransduktion und bei der Extremitätenentwicklung.

Ror2 (receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2) is a highly conserved transmembrane receptor which is implicated in a variety of cellular processes like cell polarity and cell migration. Ror2 also turned out to act as a coreceptor in different branches of the Wnt signaling cascade. Mutations in ROR2 lead to two inheritable human disorders. Recessive Robinow syndrome is caused by mutations that result in a loss of function of Ror2, probably mediated by proteasomal degradation. Mutations that truncate the protein either before or after the kinase domain result in dominant Brachydactyly type B (BDB). In both truncated isoforms, the Ror2 specific intracellular serine/threonine/proline-rich tail is lost and a gain of function effect of truncated Ror2 is assumed. The Ror2W749X mouse reflects the human distal BDB truncation of ROR2 and served as starting point for a detailed analysis of the pathogenesis of brachydactyly (BD). We defined the establishment of the phenotype temporally to E13.5 and spatially to the formation of the distal finger element (phalanges 2 and 3). In Ror2W749X mice, local defects in cell proliferation and cell recruitment result in a disturbed distal cartilage condensation. This cell population does not reach the critical size to form a medial phalanx and later on gives rise only to the distal-most element of the digit. Thus, the homozygous Ror2W749X mouse is completely lacking all medial phalanges. On signaling level, the phenotype is caused by severe disturbances in the signaling network at the distal tip of the growing digit. A locally restricted inhibition of Bmp signaling interferes with the phalanx forming region (PFR), which is essential for proximo-distal outgrowth. Blocking establishment of the PFR during formation of the medial phalanges results in the BD phenotype. Most likely, a combination of ectopic canonical Wnt signaling and reduced Ihh activity accounts for the defects in Ror2W749X mice. In a comprehensive expression analysis of all Wnt genes and their major secreted antagonists, Wnt5a and Wnt5b turned out to be the only possible Ror2 ligands for these effects. Together with several in vitro experiments, we developed a general model of digital outgrowth as well as a model of Ror2 mediated signaling network. We detected a specific interaction of Ror2 with the Bmp antagonist Noggin and additionally an interaction of Ror2 with the central mediator of Wnt signaling cascades, dishevelled (Dvl). After stimulus with Wnt5a, Ror2 specifically binds CK1 phosphorylated Dvl (ps-Dvl) and both colocalize in puncta at the cell membrane. We were also able to show the functional relevance of this interaction. It is implicated in the termination of the Wnt5a/Ror2/ATF2 signal transduction as well as in the inhibition of canonical Wnt signal transduction in vivo and in vitro. The interaction Ror2 /ps-Dvl takes place via the serine/threonine/proline-rich tail of Ror2 and is therefore a promising candidate for the explanation of the brachydactyly phenotype in the Ror2W749X mouse model as well as in human. This thesis emphasizes the central position or Ror2 within a complex network of diverse signaling cascades and especially points out the role of Ror2 as Wnt coreceptor, mediator between Wnt and Bmp signaling cascades as well as its implication in skeletal development.