Untersuchung zur Verbesserung der Tumorspezifität onkolytischer Adenovektoren sowie Entwicklung von Adenovektoren mit pharmakologisch regulierbarer Expression von Fas-Ligand

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Ursachen, die zum Verlust der Spezifität der tumorzell- und gewebespezifischen Promotoren (ttsP) nach deren Integration in ein Adenovirusgenom führen und in welcher Form dadurch die Virusreplikation beeinflusst wird. Basierend auf dem Nachweis der unterschiedlichen Einwirkung viraler und nicht viraler Faktoren, konnte die Spezifität der Virusreplikation optimiert werden. Weiterhin erwies sich die Entwicklung eines replikationsdefizienten Adenovirus (rdAdV), welches durch zusätzliche Insertion eines proapoptotischen Dox-regulierbaren Gens Tumortoxizität erzielte, als vielversprechender Strategieansatz für die Tumortherapie. 1\. Nach dem Einsatz der ttsP in einem Luciferase- exprimierenden rdAdV zeigten die ttsP im Vergleich mit den entsprechenden zellulären Promotoren eine nur bedingte Zellspezifität (Expression auch in Nicht-Targetzellen). Die folgenden unterschiedlichen Elemente beeinflussten die ttsP-Aktivität: Der sich in der 5´-terminal adenoviral sequence befindliche virale E1A-Enhancer transaktivierte alle vier untersuchten Promotoren (CEA, SPB, Tyr und AFP). Die Insertion von transkriptionalen Regulatorsequenzen in der ttsP-Region führte zum Teil zu einer Veränderung der Promotoraktivität. Einerseits erhöhte ein muriner Tyrosinase-Enhancer (2mE- Tyr-Enhancer) die Tyrosinase-Promotoraktivität, andererseits zeigte ein humaner Tyrosinase-Enhancer (2hE-Tyr-Enhancer) dagegen keine Wirkung. Das [HRE]-Element hemmte die AFP-Promotoraktivität. Diese Unterschiede wirkten sich in gleichem Maße auf die ttsP-AdV-Replikation aus. Durch die unspezifische ttsP-Aktivität exprimierte das bedingt replikationskompetente Adenovirus (Ad5tetO7CEA-E1AΔpRB und Ad5tetO7SPB-E1AΔpRB) das E1A(13S)-Protein in Nicht-Targetzellen. Dieses Protein vermittelte die Transaktivierung der ttsP und führte durch Autoaktivierung zu einer verstärkten E1A(13S)-Expression sowie zu erhöhter Virusreplikation (Abb. 4 1). 2\. Um eine externe Regulation der Transgenexpression im ttsP-AdV zu ermöglichen, wurde das Tetrazyklin- abhängige Genexpressionssystem (Tet-System) eingeführt. Durch dieses System gelang die Steuerung der ttsP-Aktivität sowie die hiervon abhängige ttsP-RRCA- Replikation. Der gleichzeitige Einsatz von Transaktivator (rtTA-M2) und Silencer (tTS) bewirkte die höchsten Regulationsraten des Transgens. Der Doxyzyklin (Dox)-kontrollierte transkriptionale Silencer (tTS) unterdrückte die unspezifische ttsP-Aktivität sowie die E1A(13S)-vermittelte Transaktivierung der ttsP. Dadurch konnte die ttsP-RRCA-Replikation zwar begrenzt, jedoch nicht vollständig blockiert werden. Im Ergebnis bietet die Verwendung des Tet-Systems in der ttsP-RRCA eine nur begrenzte Sicherheit für die Nutzung in der Tumortherapie. 3\. Als weiteren möglichen Therapieansatz wurde die Anwendung des proapoptotischen FasL-Gens in einem Adenovektor getestet. Durch das Dox-induzierbare Tight-Genexpressionssystem (erzielt durch die Veränderung von Spacer-Sequenzen im tetO7-Operon sowie Verkürzung des CMVmin-Promotors vom TRE-Genexpressionsystem) gelang eine optimierte Regulation der FasL-Expression. Der entwickelte replikationsdefizienten Adenovirus Ad5Tight-FasL verursachte nach der Dox-Induktion durch die FasL- Expression eine effektive Apoptose in der Zelllinie HeLa, wobei in nicht induzierten Bedingungen im Gegensatz zum TRE-System keine Apoptose nachzuweisen war. In den Lungenkarzinomzellen H441, BEN und DMS53 gelang der Apoptosenachweis durch die Verwendung von Ad5Tight-FasL. Die Effektivität im Vergleich zu HeLa-Zellen war allerdings 200- bis 400-fache geringer. Insofern besteht eine relative Resistenz der untersuchten Lungenkarzinomzellen gegen FasL-induzierte Apoptose. Die Insertion des FasL-Gens in einen onkolytischen Adenovektor könnte dieses Problem beheben, weil sich durch Virusreplikation die Transgenmenge erhöht. Weiterführende Untersuchungen, die auf den spezifischen Eigenschaften des FasL-exprimierenden onkolytischen Adenovektors basieren, könnten somit die Eignung für die Krebstherapie erweisen.

This study aims to analyse the cause of the leaky activity of the tumor- and tissue-specific promoters (ttsPs) after its integration in an adenoviral vector genome and how this affects the viral replication. We demonstrate which impact cause several viral and nonviral factors. Based on these findings, we were able to optimize the specificity of the virus replication. Furthermore the development of an replication deficient adenoviral vector (rdAdV) which express a proapoptotic Dox-controlled gene was proved to be a trend-setting for a new strategy approach in tumor therapy. 1\. By the insertion of the ttsPs (CEA Promoter, SPB Promoter, hTyr2E/P Promoter or [HRE]AFP Promoter) into a luciferase-expressing rdAdV shown the ttsP just a conditional cell specifity (expression also in non target cells) while its endogenous homologue kept the specificity. The analysed elements listed below influenced the ttsP activity: The 5´-terminal adenoviral E1A enhancers fused to the ttsP affected their leakiness. The insertion of transcriptional regulator elements in the ttsP region carried in part to a modification on the promoter activity. On the one hand increased the murine tyrosinase enhancer (2mE-Tyr) the tyrosinase promoter activity, on the other hand didn´t show the human tyrosinase enhancer (2hE-Tyr) any effect. The transcriptional element [HRE] inhibited the AFP promoter activity. All these effects affected to the same degree the ttsP-AdV replication. The restricted replication competent adenovirus (Ad5tetO7CEA- E1AΔpRB and Ad5tetO7SPB-E1AΔpRB) expressed through the leaky ttsP activity the E1A(13S) protein. This protein mediate the transactivation of the ttsP and induce via autoactivation feedback loop an increased E1A(13S) expression and virus replication. 2\. Based on these cognitions was introduced a tetracyclin- controlled system in the ttsP-AdV which enables a extrinsic transgene expression regulation. Through this system succeeded the control of the ttsP activity and ttsP-RRCA replication. Substantial findings of this work consist in the confirmation that the doxycyclin (Dox)-controlled transcriptional silencer (tTS) can inhibit the ttsP-RRCA replication through the blocking of the leaky ttsP activity and through the arresting of the E1A(13S) transactivation. The tTS showed itself as an universal inhibitor of the ttsP activity. As long as is not possible a complete blocking of the leaky ttsP- RRCA replication, offers the use of a tetracyclin system in the ttsP-RRCA only a limited security for its use in tumor therapy. 3\. Another therapy approach was tested by the insertion of the proapoptotic FasL gene in an adenoviral genome. Through the modified Dox-controlled gene expression system (Tight- system) succeeded an optimized regulation in the FasL expression. The new developed replication deficient adenoviral vector Ad5Tight-FasL caused effective apoptose via FasL expression under Dox induction in the cell line HeLa, whereas was not detect in non induction conditions, in contrast to the original TRE-system. By the trials in lung cancer cells (H441, BEN and DMS53) it was possible to detect apoptose by the application of Ad5Tight-FasL, however was the effectivity 200 to 400 fold lower than in HeLa cells. In this respect possess lung cancer cells a relativ resistance against FasL-induced apoptose. The insertion of the FasL gene in an oncolytic adenovector may remedy this problem. Further research on the basis of FasL-expressed oncolytic adenovectors could demonstrate its applicability for cancer therapy.