Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food and characterization of epidemiologically important Salmonella enterica subsp. enterica serovars isolated from livestock, food and humans

Abstract

Traditional routine diagnostic microbiology on Salmonella consists generally of culture-based detection and identification of the microorganism on species level, and differentiation into certain phenotypes by serological methods. Further discrimination is achieved by antimicrobial resistance as well as phage typing, e.g. in the case of surveillance and epidemiology studies. In addition, within the past two decades microbial genotyping has tremendously improved our knowledge of how Salmonella can transmit from animals through the food chain to humans. This thesis contributes to facilitating the detection of Salmonella and to gaining a better knowledge of the spread of Salmonella from animals to humans in three respects: firstly, a rapid and sensitive detection method for Salmonella from food samples has been developed based on real-time PCR and extensively validated. Secondly, a new approach for low-number enumeration of Salmonella was developed as a proof-of-principle and thirdly, the transmission pathways of epidemiologically important Salmonella enterica serovars from livestock through food to humans were investigated by phenotypic and genotypic methods. By virulence and antimicrobial resistance typing in combination with epidemiological data the potential hazard for humans of certain genotypes has been estimated. The validated real-time PCR detection method for Salmonella, which has been officially approved in Germany, is as accurate as traditional reference ISO 6579:2002 and places in the hands of food diagnostic laboratories a rapid, robust and cost-effective screening tool. Primers and TaqMan probe target specifically sequences within the ttr locus of Salmonella. The analytical assay was the basis for the quantification of salmonellae in low numbers in cork borer samples from pigs in combination with an eight-hour enrichment step where most bacterial growth is in the log phase. The proof-of-principle can be easily applied to other food samples by adaptation of the enrichment time. The characterization of the pathogenicity gene repertoire of two frequently isolated S. enterica serovars, 4,12:d:- and multidrug-resistant Paratyphi B d-tartrate + (O:5 antigen negative), from poultry estimated the potential hazard for humans as rather low compared to that of other broad-host-range S. enterica serovars (e.g. Enteritidis). In contrast, S. enterica serovars 4,[5],12:i:- and Derby frequently found in pigs and transmitted by the one vehicle pork could be identified to be a major infection source for humans. The prevalence of S. enterica serovar 4,[5],12:i:- has continuously increased especially in pigs and humans since the beginning of the 2000s. Two different subtypes of the monophasic serovar have been identified as prevalent in Germany. The genetic background of the subtypes and serovar is highly similar to that of S. enterica serovar Typhimurium but lacking functional genes in the genome encoding the phase two flagellum antigen H2:1,2. Overall certain subtypes or clonal lineages of the S. enterica serovars investigated, some of them highly multidrug-resistant, represent a risk for human health through transmission by food. To prevent these serovars from entering the food chain and from the potential dissemination of antimicrobial resistance determinants to related microorganisms, both the farm and food production levels should be subject to rigorous Salmonella control measures.

Die mikrobiologische Routinediagnostik für Salmonella besteht traditionell aus Kultur-basierten Nachweisverfahren und der Identifizierung des Mikroorganismus auf Spezies-Level, sowie der Differenzierung in bestimmte Phänotypen durch serologische Verfahren. Eine weitergehende Diskriminierung, z.B. im Fall von Überwachungs- und epidemiologischen Studien, erfolgt durch antimikrobielle Resistenz- als auch Phagentypisierung. Zusätzlich hat die mikrobielle Genotypisierung in den vergangenen zwei Jahrzehnten unser Wissen bedeutend verbessert, wie Salmonella vom Tier über die Lebensmittelkette zum Menschen übertragen wird. Diese Habilitationsschrift trägt in drei Aspekten dazu bei, den Nachweis von Salmonellen zu vereinfachen und das Wissen zur Verbreitung von Salmonella vom Tier zum Menschen zu vertiefen: Erstens, wurde eine schnelle und sensitive Nachweismethode für Salmonella in Lebensmittelproben basierend auf der real-time PCR entwickelt und ausgiebig validiert. Zweitens, wurde ein neues Vorgehen als Proof-of-Principle für die Zählung von niedrigen Mengen von Salmonella entwickelt und, drittens, wurden die Übertragungswege von epidemiologisch wichtigen Salmonella enterica Serovare ausgehend von Tierbeständen über Lebensmittel zum Menschen unter Anwendung von phänotypischen und genotypischen Verfahren untersucht. Durch Virulenz- und antimikrobielle Resistenztypisierung unter Zuhilfenahme von epidemiologischen Daten wurde daraus das Gefahrenpotential bestimmter Genotypen für den Menschen abgeschätzt. Das validierte real-time PCR Nachweisverfahren für Salmonella, das offiziell in Deutschland bereits annerkant ist, ist so genau wie das traditionelle Referenzverfahren nach ISO 6579:2002 und gibt Lebensmittel- bearbeitende Diagnotiklabore ein schnelles, robustes und kostengünstiges Screeningwerkzeug in die Hand. Die Primer und TaqMan Sonde erkennen spezifische Sequenzen innerhalb des ttr Locus von Salmonella. Das analytische Testverfahren war auch die Grundlage für die Quantifizierung von Salmonellen in niedrigen Mengen aus Korkbohrerproben vom Schwein in Zusammensetzung mit einem acht Stunden Anreicherungschritt, in dem das bakterielle Wachstum zum großen Teil sich in der log-Phase befindet. Der Proof-of-Principle kann durch die Anpassung der Anreicherungszeit einfach auf andere Lebensmittelproben angewendet werden. Durch die Charakterisierung des Pathogenitätsgenrepertoires der zwei häufig aus Geflügel isolierten S. enterica Serovare 4,12:d:- und multiresistente Paratyphi B d-Tartrat + (O:5 Antigen negativ) konnte das Gefahrenpotential für Menschen im Vergleich zu anderen Wirtsbereich-breiten S. enterica Serovare (z.B. Enteritidis) als eher gering eingeschätzt werden. Im Gegensatz dazu konnten die S. enterica Serovare 4,[5],12:i:- und Derby, die häufig in Schweinen gefunden werden und durch das Vehikel Schweinefleisch übertragen werden, als bedeutende Infektionsquelle für den Menschen identifiziert werden. Die Verbreitung des S. enterica Serovars 4,[5],12:i:- ist insbesondere in Schweinen und Menschen seit Anfang der 2000er kontinuierlich angestiegen. Zwei verschiedene Untergruppen des monophasischen Serovars werden in Deutschland häufig beobachtet. Der genetische Hintergrund der Untergruppen bzw. des Serovars ist sehr ähnlich zu dem von S. enterica Serovar Typhimurium, es fehlen jedoch funktionelle Gene im Genom, die das Phase 2 Flagellum Antigen H2:1,2 kodieren. Insgesamt repräsentieren bestimmte Untergruppen oder klonale Linien von den untersuchten S. enterica Serovaren, einige von ihnen hoch multiresistent, ein Risiko für die menschliche Gesundheit durch die Übertragung über Lebensmittel. Um den Eintritt dieser Serovare in die Lebensmittelkette und die mögliche Übertragung von antimikrobiellen Resistenzdeterminanten auf verwandte Mikroorganismen zu verhindern, sollten Erzeuger- und Lebensmittelproduktionsebenen rigorose Salmonella Kontrollmaßnahmen unterliegen.