Investigation of nanoparticle toxicity: Characterization of protein corona and evaluation of oxidative stress by protein carbonylation

Abstract

The constant development of new nanoparticles (NPs) with different properties (size, material, coating, etc.) necessitates a priorization in hazard assessment, which in turn requires reliable screening methods. Classification or grouping of NPs however requires consideration of toxicological modes of action as well as a NP characterization including intrinsic and system dependent (“in situ”) properties. The latter in turn are able to influence the NPs’ biological effect. The protein corona (PC) for instance governs the interaction of NPs with cells while the NP agglomeration behavior may influence their sedimentation and thereby the particle dose reaching the cells. Based on these concepts, the first part of this thesis describes the influence of surface modifications on the system dependent properties of NPs. It is focused on modified SiO2 and, ZrO2 NPs. While surface charge is a major influencing factor, NP lipid interactions were mainly governed by the binding of lung surfactant proteins. Qualitative and quantitative analysis of the PC showed that the formation depended on chemical composition, surface modification as well as on time of incubation. The study allowed for the first time a correlation between in situ results and the results of an in vivo short time inhalation study in rats using the same NPs. We found that the speed of PC formation was correlated with the observed inflammatory reactions in the rat lungs, while NP lipid interactions were correlated with the lung burden observed in vivo Oxidative stress is one cause for NP toxicity. One result of oxidative stress is the presence of reactive oxygen species in the cell, which can react directly or indirectly with cellular proteins and thereby form carbonyls. Thus, the second part of the thesis focused on the analysis of protein carbonyls. Here, a broad spectrum of NPs was tested for the induction of protein carbonylation in the NRK-52E cell line using a 1D/2D-immunoblot approach. Very high correlations between carbonylation and cell viability (84%) as well as surface reactivity (83%) were found. A proteomic identification of the carbonylated proteins allowed a first insight into possible toxicity mechanisms. The NP specific carbonylation patterns were used for statistical evaluation, which allowed a first grouping of the used materials. In summary, it was concluded that the protein carbonylation analysis is suitable as a screening method supporting prioritization. Identification of carbonylated proteins can even be used for classification or grouping approaches. Moreover, the ability to gain insights into modes of action is of great value, as this might enable the deciphering of adverse outcome pathways and could be used in predictive toxicology. The dataset presented here is therefore an excellent starting point to unravel nanomaterial grouping strategies.

Die fortdauernde Entwicklung neuer Nanopartikel (NP) mit verschiedenen Eigenschaften (Material, Oberflächenmodifikationen, etc.) erfordert eine Priorisierung dieser Materialien in ihrer Gesundheitsbewertung. Dafür werden zuverlässige Screening-Methoden benötigt. Für eine Klassifizierung oder Gruppierung müssen toxikologische Wirkungsweisen ebenso wie die Charakterisierung der Materialien hinsichtlich intrinsischer und systemabhängiger („in situ“) Eigenschaften betrachtet werden, wobei auch letztere wiederum die biologische Wirkung der NP beeinflussen. Die Proteinkorona z.B. bestimmt die Interaktion von NP mit Zellen. Das Agglomerationsverhalten hat über die Sedimentation der NP Einfluss auf die Dosis, welche die Zellen erreicht. Daher befasst sich der erste Teil dieser Arbeit mit dem Einfluss von Oberflächenmodifikationen auf die systemabhängigen Eigenschaften von NP. Der Schwerpunkt lag auf oberflächenmodifizierten SiO2 und ZrO2 NP. Die Oberflächenladung hat großen Einfluss auf das in situ Verhalten der NP , bestimmt die Bindung von Surfactantproteinen der Lunge und die Interaktion mit lipidhaltigen Medien. Qualitative und quantitative Analysen der Proteinkorona zeigten, dass die Proteinadsorption von Material, Oberflächenmodifizierung und Inkubationszeit abhängig ist. Die Ergebnisse erlaubten zum ersten Mal eine direkte Korrelation zwischen der Charakterisierung in situ und von in vivo Daten einer Inhalationsstudie an Ratten mit denselben NP. Hier zeigten sich Korrelationen zwischen der Proteinadsorptionsgeschwindigkeit und den einzelnen Entzündungsparametern in der Lunge, sowie zwischen der NP-Lipidinteraktion und der Lungenbelastung in vivo. Oxidativer Stress ist ein häufig für NP-Toxizität identifizierter Mechanismus. In dessen Folge können reaktive Sauerstoffspezies entstehen, welche wiederum direkt oder indirekt mit Proteinen reagieren. Sie können diese auch carbonylieren. Daher lag der Fokus im zweiten Teil der Arbeit auf der Untersuchung solcher Proteincarbonyle. Zum einen wurde ein Screening-Ansatz verfolgt, zeitgleich aber auch die Untersuchung toxikologischer Wirkmechanismen auf Basis der Proteincarbonyle. Ein breites Spektrum von NP wurde in NRK-52E Zellen mittels Carbonylspezifischem 1D/2D-Immunoblot untersucht. Hier fanden sich extrem hohe Korrelationen zwischen Carbonylierung und Viabilität (84%) sowie Oberflächenreaktivität der NP (83%). Die Identifizierung der carbonylierten Proteine ließ einen ersten Einblick in mögliche Wirkmechanismen zu, während die statistische Auswertung der NP- spezifischen Carbonylierungsmuster eine erste Gruppierung erlaubte. Insgesamt zeigte sich, dass diese Methode neben der Verwendung als Screening-Ansatz auch für Einblicke in Wirkmechanismen und damit den Aufbau von „Adverse Outcome Pathways“ nützlich ist. Der hier generierte Datensatz ist daher eine gute Basis für die Entwicklung von Gruppierungsansätzen.