Evaluation der Biokompatibilität von mit autologen Zellen beschichtetem xenogenen Gewebe im Tiermodell

Abstract

Einleitung: Der Ersatz von Herzklappen mittels biologischer Prothesen ist der in Deutschland häufigste Eingriff an Klappenapparat des Herzens. Die verwendeten Prothesen sind mit mehreren Problemen, wie Degeneration, Kalzifikation, fehlender Wachstums- und Regenerationsmöglichkeit und damit einer hohen Re-Operationsrate verbunden. Das Tissue Engineering, welches in den letzten Jahren im Mittelpunkt vieler Forschungsvorhaben steht, stellt eine viel versprechende Methode dar, um diese Probleme zu lösen. Dabei versucht man mit Hilfe körpereigener Zellen autologes Gewebe nachzubilden. Dadurch soll eine der natürlichen Herzklappe möglichst ähnliche, regenerationsfähige Prothese entstehen. Bis jetzt steht noch keine ideale Matrize zur Verfügung, welche als Grundgerüst für die Entstehung der Klappe dient. Des Weiteren ist auch noch nicht klar, durch welche autologen Zellen die Re-Population der Matrizen und auf welchem Wege diese erfolgen soll. Aktuell zeigt sich dezellularisiertes xenogenes Gewebe, aufgrund einer intakten extrazellulären Matrix, als beste Alternative. Methoden: In der Arbeit wird der Einfluss von Dezellularisation und autologer Endothelzellbesiedlung auf porcine Matrizen im subkutanen Rattenmodell beschrieben. Dazu werden aortale und pulmonalarterielle porcine Gewebe-stücke verwendet. Diese werden zum Teil dezellularisiert und mit Endothel-zellen, welche aus der Vena jugularis der jeweiligen Versuchstiere isoliert sind, besiedelt. Nach Explantation und makroskopischer Begutachtung der Matrizen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Implantation (2, 4 und 6 Wochen) wird eine Hämatoxylin-Eosin Färbung zur Beurteilung der zellulären Infiltration durchgeführt. Eine Färbung CD 68 positiver Zellen (Makrophagen und Monozyten) wird durchgeführt um inflammatorische Prozesse darzustellen. Des Weiteren werden Fibroblasten, als wesentliche an der Neubildung der extrazellulären Matrix beteiligte Zellen, angefärbt und eine Von Kossa Färbung wird durchgeführt, um Kalzifikationsherde aufzuzeigen. Ergebnisse: Makroskopisch zeigt sich um die nicht dezellularisierten, als auch um die pulmonalarteriellen Matrizen eine stärkere Entzündungsreaktion. Auch in der Hämatoxylin-Eosin Färbung sieht man eine signifikant stärkere zelluläre Infiltration dieser Matrizen. Dabei stellen sich die Zellen als hautsächlich leukozytären Ursprungs dar. Dies wird auch in der verstärkten Infiltration der nicht dezellularisierten und der pulmonalarteriellen Matrizen mit CD 68 positiven Zellen verdeutlicht. Bei Begutachtung der histologischen Präparate fällt auch eine verstärkte zelluläre Infiltration an den Schnittkanten der Gewebestücke auf. In der Färbung der Fibroblasten sieht man eine signifikant stärkere Infiltration der dezellularisierten Matrizen, als auch der Matrizen in denen eine verstärkte leukozytäre Infiltration vorliegt. Um die endothelialisierten Matrizen kann keine Endothelzellschicht nachgewiesen werden. Anstelle dessen zeigt sich aber eine verstärkte Bildung von Blutgefäßen. Die Von Kossa Färbung zeigt keine Kalzifikation in den dezellularisierten Matrizen, dagegen aber in den nicht dezellularisierten Matrizen. Schlussfolgerung: Um dem Ziel eines langfristig kompetenten Herzklappenersatzes möglichst nahe zu kommen, sollte beim Tissue Engineering schlussendlich rein autologes Gewebe entstehen. Fibroblasten sind für die Neubildung der extra-zellulären Matrix verantwortlich und damit essentiell für den Aufbau regenerationsfähigen Gewebes. In der Arbeit zeigt sich eine gute Infiltration der dezellularisierten Matrizen mit diesen Zellen. Eine für die Anforderungen im Blutkreislauf suffiziente Gewebsregeneration und Neubildung kann in diesem subkutanen Modell allerdings nicht beurteilt werden. In den dezellularisierten Matrizen kann aufgrund der reduzierten zellulären und monozytären Infiltration von einer verminderten inflammatorischen Reaktion ausgegangen werden. Somit ist durch die Dezellularisierung eine Verminderung der Antigenität des Gewebes erreicht worden. Trotz dessen findet sich auch in diesen Matrizen eine verstärkte Infiltration an den Schnitt-kanten, was für eine Freilegung antigener Strukturen spricht, aber auch durch die subkutane Lage der Gewebstücke bedingt sein könnte. Die verstärkte Infiltration der pulmonalarteriellen Matrizen spricht für eine höhere Antigenität pulmonalarteriellen porcinen Gewebes im Gegensatz zu aortalen porcinen Gewebe und sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Kalzifikation ist eines der Hauptprobleme biologischer Herzklappenersätze und als Ausdruck verschiedener Probleme, wie zum Beispiel zellulärer Rückstände und inflammatorischer Vorgänge, anzusehen. Die komplette Entfernung von Zellbestandteilen wurde für diese Dezellularisierungsmethode schon beschrieben und eine Reduktion der Antigenität konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Dies spiegelt sich in der hier fehlenden Kalzifikation dezellularisierter Matrizen wieder. Die verstärkte Bildung von Blutgefäßen nach in vitro Endothelzellbesiedlung in diesem Versuch scheint durch die subkutane Lage der Matrizen und die Beeinflussung der Zellen durch das umliegende Gewebe bedingt zu sein. Das Tiermodell ist aus diesem Grund nicht geeignet, um die Auswirkung einer konfluenten Endothelzellschicht darzustellen.

Background: Biological heart valve replacements are the mainly and increasingly used prostheses in Germany. They are associated with certain problems like degeneration, calcification and lack of regenerative or growing potential. Tissue engineering is a promising approach to overcome these problems by creating viable tissue using autologous cells. Key for creating tissue engineered heart valves are optimal scaffolds, showing good bio- compatibility and allowing in vivo assembling of heart valves, which have regenerative potential. Decellularized tissue seems, due to intact extra- cellular matrix, the best alternative. Repopulation of the decellularized tissue is possible in vitro and in vivo, but until now without knowing which way is beneficial. Methods: In this study we want to evaluate the impact of decellularization and endothelial-cell-coating to porcine tissue. Therefore aortic and pulmonic porcine tissue specimens are used, which are in parts decellularized and coated with endothelial cells. 30 Lewis rats are investigated using the subdermal model. After explantation and gross examination of the tissue specimens Haematoxylin/Eosin-staining, Von-Kossa- staining, CD-68-positive-cell-staining, von-Willebrand-Factor-staining and Fibroblast-staining is performed and quantitative evaluations conducted. Results: In gross examination we see stronger inflammatory reaction surrounding decellularized and pulmonic tissue. Histological evaluation in Haematoxylin/ Eosin staining shows significant decrease of inflammatory reaction (confirmed by staining for monocytes/ macrophages) in aortic and pulmonic scaffolds after decellularization. Significantly less inflammatory response (p<0.05) can also be seen in aortic as compared to pulmonic tissue. Besides this, stronger inflammatory reaction imposes at the cutting edge of all specimens. Fibroblasts could be detected in all specimens with strongest infiltration in decellularized scaffolds and in specimens with increased inflammatory reaction. Surrounding the tissue specimens, which were coated with endothelial cells, no monolayer of endothelial cells can be found, but a significant increase of blood vessels imposes. Von Kossa staining shows no calcification in decellularized in contrast to non-decellularized tissue. Conclusion: To create viable heart valves, fibroblasts are essential, as producers of the extracellular matrix. Infiltration of decellularized tissue with these cells is shown, but of course the functionality of the tissue can not be displayed in this subdermal model. Results indicate that decellularization reduces inflammatory response of both, pulmonic and aortic tissue, what could be cause for the absence of calcification in decellularized tissue. But pulmonic tissue shows even if decellularized a higher inflammatory potential than aortic tissue. The reason could be a different configuration in the extra-cellular assembling and therefore more antigenic structures. Increased inflammatory reaction is seen at cutting edges of the specimens. Destroyed collagen or a disintegration of the extra-cellular matrix possibly induces this. But also the subdermal location of the specimens could account for this as we do not see this reaction in study setups where decellularized heart valves are implanted directly in blood circulation. The lack of an endothelial monolayer and increased blood vessel density of in vitro endothelialized specimens is most probably due to the subdermal position of the tissue specimens. Therefore effects of an endothelial layer need to be investigated in different study setups.