dc.contributor.author
Wolf, Kai-Uwe
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:36:42Z
dc.date.available
2002-12-05T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13600
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17798
dc.description
0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung 1
1.1. Die Familie der Picornaviren 1
1.1.1 Das Humane Rhinovirus Typ 14 (HRV-14) 6
1.1.2 Die Virusstruktur von HRV-14 6
1.2. Virusrezeptoren 9
1.2.1. ICAM 1 als Virusrezeptor für HRV-14 12
1.3. Der Reproduktionsmechanismus von Picornaviren 16
1.4. Zielsetzung 22
2\. Material und Methoden 23
2.1. Abkürzungen 23
2.2. Verwendete Medien 25
2.3. Verwendete Lösungen, Puffer und Seren 27
2.1. Eingesetzte Substanzen 14
2.4. Zellen 31
2.4.1. HeLa-Zellen 31
2.4.2. BHK-Zellen 31
2.4.3. BHK-ICAM-1-Zellen 31
2.4.3.1. Transfektion von BHK-Zellen mit ICAM 1 32
2.5. Propagierung von HRV-14 und Coxsackievirus A21 33
2.6. Hochreinigung von HRV-14 34
2.7. RNA-Synthese-Test 35
2.7.1. RNA-Synthese-Inhibitions-Test 37
2.8. Plaque-Test 38
2.8.1. Plaque-Reduktions-Test 39
2.9. Endpunktstitration 40
2.10. Elektronenmikroskopie 41
2.11. ELISA zum Nachweis von membranständigem ICAM 1 (ICAM 1-ELISA) 42
2.12. ELISA zum Nachweis von zellgebundenem HRV-14 (HRV 14-ELISA) 43
2.13. Gradientenzentrifugation 45
2.14. Die Markierung viraler Proteine mit 35S-Methionin 46
2.15. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 47
3\. Ergebnisse 49
3.1. Die Einschleusung von HRV-14 in HeLa-Zellen durch rezeptorvermittelte
Endozytose 49
3.1.1. Viruseinschleusung und morphologische Veränderungen in HeLa-Zellen im
Elektronenmikroskop nach Infektion mit HRV-14 49
3.1.2. Die Beteiligung von ICAM 1 an der Einschleusung in HeLa-Zellen 51
3.1.2.1. Die Blockierung der Adsorption von HRV-14 mit Anti-ICAM 1 52
3.1.2.2. Die Kompetition der Adsorption von HRV-14 mit löslichem ICAM 1:Ig
54
3.1.2.3. Das pH-abhängige Uncoating von HRV-14 59
3.2. Die Einschleusung von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 61
3.2.1. Der Nachweis von ICAM 1 auf BHK-ICAM 1-Zellen 1-Zellen 62
3.2.2. Viruseinschleusung und morphologische Veränderungen in BHK-ICAM
1-Zellen im Elektronenmikroskop im Vergleich zu BHK-Zellen nach Infektion mit
HRV-14 63
3.2.3. Die Beteiligung von ICAM 1 an der Einschleusung von HRV-14 in BHK-ICAM
1-Zellen 66
3.2.3.1. Der Nachweis der Bindung von HRV-14 an BHK-ICAM 1-Zellen 66
3.2.3.2. Die Bestimmung der RNA-Synthese von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 68
3.2.3.3. Die Bestimmung von infektiöser Virusnachkommenschaft von HRV 14 in
BHK-ICAM 1-Zellen 69
3.2.3.4. Die Bestimmung von infektiöser Virusnachkommenschaft von HRV 14 im
Vergleich zu Coxsackievirus A21 in BHK-ICAM 1-Zellen 71
3.2.3.5. Die Bestimmung von HRV-14-Proteinen in BHK-ICAM 1-Zellen im
Vergleich zu HeLa- und BHK-Zellen 74
4\. Diskussion 78
4.1. Verlauf der frühen Reproduktionsschritte von HRV-14 in HeLa-Zellen 78
4.2. Einfluss von ICAM 1 als Virusrezeptor von HRV-14 auf die Adsorption und
Penetration von HRV-14 in transfizierte BHK-ICAM 1-Zellen 79
4.3. Einfluss von virusbindenden Rezeptoren auf die Permissivität von
transfizierten Zellen 81
4.4. Ablauf der frühen Reproduktionsschritte am Beispiel von Picornaviren,
Semliki Forest Virus und Influenzaviren 83
4.4.1. Wechselwirkung des Virus mit dem Virusrezeptor und Aufnahme des Virus
in die Zelle 83
4.4.2. Uncoating und Freisetzung der viralen RNA 85
4.4.3. Initiation der Translation zu Beginn des ersten Replikationszyklusses
88
4.5. Mögliche Ursachen des Effekts von zellgebundenem ICAM 1 auf die Aufnahme
von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen im Unterschied zu HeLa-Zellen 93
5\. Zusammenfassung 96
6\. Literatur 97
dc.description.abstract
Es wurden die frühen Reproduktionsschritte vom Schnupfenvirus (Humanes
Rhinovirus Typ 14, HRV-14) mit der Fragestellung untersucht, inwieweit der
Virusrezeptor allein die Infektion von Zellen determiniert. Dazu wurden BHK-
Zellen eingesetzt, die durch den fehlenden Virusrezeptor Intercellular
Adhesion Molecule 1 (ICAM 1) nicht in der Lage sind, mit HRV-14 infiziert zu
werden. Als infizierbare Zellen dienten ICAM-1-tragende und für HRV-14
empfängliche HeLa-Zellen. Zur Klärung der Frage, ob der Virusrezeptor allein
für eine Infektion einer Zelle verantwortlich ist, wurden nichtinfizierbare
BHK-Zellen mit dem Virusrezeptor ICAM 1 transfiziert (BHK-ICAM 1-Zellen). Für
HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, dass HRV-14 über die Vermittlung von ICAM 1
als Virusrezeptor in ?clathrin coated? Vesikel aufgenommen wird, und es
anschließend über einen pH-abhängigen Schritt zum Uncoating des Virus mit
Freisetzung der viralen RNA für die nachfolgende Translation und Neusynthese
viraler RNA kommt. Die Neusynthese reifer Rhinoviren wurde
transmissionselektronenmikroskopisch und durch Bestimmung infektiöser
Virusnachkommenschaft belegt. Anders verlief die HRV-14 Infektion bei BHK-ICAM
1-Zellen. Es war zwar eine transmissionselektronenmikroskopisch nachgewiesene,
rezeptorvermittelte Virusaufnahme zu beobachten, jedoch konnte im weiteren
Verlauf der Reproduktion weder eine Neu-synthese von viraler RNA und viralen
Proteinen noch von reifen Rhinoviren nachgewiesen werden. Bei BHK-ICAM
1-Zellen wurde die Ausbildung intrazellulärer, lan-ger schlauchförmiger,
virushaltiger Membransysteme beobachtet. ICAM 1 war als virusspezifischer
Rezeptor auf BHK-ICAM 1-Zellen funktionell aktiv, wie durch eine produktive
Infektion mit Coxsackievirus A21, das ebenfalls ICAM 1 als Virusrezeptor
besitzt, gezeigt werden konnte. Die Ergebnisse erlauben den Schluss, dass in
BHK-ICAM 1-Zellen eine Blockade im Reproduktionszyklus von HRV-14 vorliegt.
Diese Blockade im Reproduktionszyklus erfolgt nach der Virusadsorption bei
oder kurz nach dem Uncoating. Es bleibt zu klä-ren, ob die Blockade auf der
Ebene der Initiation der viralen Translation oder viralen Transkription liegt.
de
dc.description.abstract
It is generally accepted that virus receptors are the main determinants for
permissiveness as shown for poliovirus by Holland and Mc Laren nearly for
forty years. The early steps of reproduction of human rhinovirus type 14 (HRV
14) were studied to what ex-tent the virus receptor ICAM-1 alone determinates
the infection of cells. BHK cells that lacks the virus receptor intercellular
adhesion molecule 1 (ICAM 1) were not suscepti-ble by HRV-14. As permissive
cells HeLa cells were used. To study the influence of the virus receptor about
the susceptibility of cells BHK cells were transfected with ICAM-1 (BHK-ICAM-1
cells). I could show for HeLa cells that HRV-14 is internalized via coated
pits and coated vesicles by receptor-mediated endocytosis. A pH-dependent
entry mechanism could by demonstrated by exploiting the action of monensin as
an ionophore which raises the pH in the acidic endosomes and lysosomes. The
progeny of new rhinoviruses was detected by transmission electron microscopy
and the measure of infectious virus by plaque titration. Differently, the
HRV-14 infection proceeded at BHK-ICAM 1-cells. In contrast to HeLa cells
virus internalization into BHK-ICAM-1 cells were receptor mediated, too. But
nei-ther a synthesis of viral RNA nor a production of infectious rhinoviruses
was detected. Long chains of virus particles were located in membrane tubes.
Virus particles were lined up in these channels like pearls on a string, but
did not induce a productive infec-tion. ICAM-1 acts as a functional virus
receptor on the transfected cells as shown in infection experiments with
coxsackievirus A21. This virus, as HRV-14, utilizes ICAM-1 as its receptor.
Coxsackievirus A21 replicated in BHK-ICAM-1 cells in titers similar to those
of HeLa cells. These results suggest that ICAM-1 was not sufficient to render
transfected BHK cells permissive to HRV-14. The replication of HRV-14 in BHK-
ICAM-1 cells was blocked directly during its uncoating or shortly after. It is
not clearly if the blockade is localizing at the step of the initiation of
viral translation or the step of the initiation of viral transcription.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Human rhinovirus 14 Intercellular adhesion molecule-1 Virus entry Susceptibility
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Die Einschleusung von humanem Rhinovirus Typ 14 (HRV-14) in HeLa-, BHK- und
BHK-ICAM-1- Zellen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Heinz Zeichhardt
dc.contributor.furtherReferee
Priv.Doz. Dr. Mathias Pauschinger
dc.date.accepted
2002-12-13
dc.date.embargoEnd
2002-12-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002002685
dc.title.translated
The internalization of human rhinovirus type 14 (HRV-14) in HeLa-, BHK- and
BHK-ICAM-1- cells
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000793
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/268/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000793
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free
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open access