Antileishmanielle Aktivität und zytotoxisches Potential von Resveratrol

Abstract

Resveratrol (3,4’,5-trans-Trihydroxystilben) ist ein natürlich vorkommendes Phytoalexin, welches in der Pflanze als Reaktion auf UV-Strahlung, Mikrobenbefall oder bei Gewebezerstörung gebildet wird. Resveratrol ist vor allem deshalb von großem Interesse, da es ein mit der Ernährung leicht zugängliches diätetisches Phytopharmakon ist, dem eine Vielzahl positiver Wirkungen auf den Organismus zugeschrieben wird. Hierzu zählen die antioxidative Aktivität, die Eigenschaft als Radikalfänger, die Modulation von Stoffwechselprozessen einschließlich des Fettstoffwechsels, chemopräventive bzw. antikanzerogene Effekte und eine estrogene Aktivität. Über eine antiparasitäre Wirkung – konkret über eine antileishmanielle Aktivität – gibt es indes nur eine einzige richtungsweisende Untersuchung. Diese antileishmanielle Aktivität wurde in der vorliegenden Arbeit mit Blick auf den Wirkmechanismus evaluiert. Resveratrol wurde in dieser Arbeit mithilfe eines breiten Methodenspektrums (MTT-Assay, durchflusszytometrische Analyse, mikroskopische Untersuchungen) hinsichtlich seiner antileishmaniellen Aktivität gegenüber Leishmania major-GFP beurteilt. Die FACS-Analyse zeigte eine nur moderate Aktivität gegenüber promastigoten Parasiten im Konzentrationsbereich ≤ 35 µg/mL (≙ ≤ 153,2 µM), jedoch deutliche antileishmanielle Effekte bei höheren Testkonzentrationen ≥ 45 µg/mL (≙ ≥ 197,2 µM). Zudem konnte eine konzentrationsabhängige Reduktion des GFP-Signals bei infizierten Makrophagen (BMMΦ und J774-G8) beobachtet werden (IC50-Werte: BMMΦ 9,9 µg/mL (≙ 43,6 µM) und J774-G8: 24,8 µg/mL (≙ 108,6 µM)). Überraschenderweise schwächte Resveratrol eine wichtige Abwehrstrategie der Makrophagen gegen intrazelluläre Erreger ab, die NO-Bildung. Neben dem Nachweis, dass Resveratrol nur moderate direkte NO-Scavenging-Aktivitäten im zellfreien (SNP) und zell-basierten Assay aufwies, zeigte der Western Blot eine reduzierte Expression der iNOS-Proteinmengen nach Behandlung der Makrophagen mit Resveratrol. Die Beobachtung der mit zunehmender Resveratrol- Konzentration verstärkten zytotoxischen Effekte führen auf der einen Seite zu der Erkenntnis, dass Resveratrol kein geeignetes antileishmanielles Agens darstellt. Auf der anderen Seite kann die Zytotoxizität eine geeignete Stoffeigenschaft und Vorraussetzung für die Behandlung von anderen sich auf dem Vormarsch befindlichen Krankheiten sein, wie z. B. Krebs. Demzufolge waren Untersuchungen zur antikarzinogenen Aktivität von Resveratrol unverzichtbar und stellen einen weiteren wesentlichen Aspekt dieser Arbeit dar. Unter Verwendung der humanen Lungenkrebszelllinie A549 wurde auch der Zusammenhang zwischen der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und deren Auswirkung auf Krebszellen evaluiert. Resveratrol löste in der A549-Zelllinie in Konzentrationen ≥ 15 µg/mL (≙ 65,7 µM) den programmierten Zelltod aus. Die Resveratrol-induzierte Apoptose verlief dabei Caspase-abhängig, nachgewiesen durch Aktivierung der Caspase 3 sowohl in einem kolorimetrischen Assay als auch mittels Western Blot-Analyse. Neben Erkenntnissen über das Zusammenspiel zwischen einer erhöhten ROS-Konzentration und der Apoptose-Induktion konnte zudem die Herkunft der ROS-Spezies im verwendeten A549-Zellmodell geklärt werden.

Resveratrol (3,4’,5-trihydroxy-trans-stilbene), a naturally occurring phytoalexin, that is generated in plants in response to UV radiation, microbes or tissue destruction. It is one of the most important polyphenolic substances for which a number of health-promoting properties were discovered. Resveratrol has been receiving increasing interest particularly because it is easily available with the diet. In fact, resveratrol-rich ‘dietary’ phytopharmacons are suggested to exert beneficial pleiotropic health effects. These include antioxidant activity, radical-scavenging, modulation of metabolic processes (including lipid metabolism), chemopreventive, and anti-carcinogenic effects as well as estrogenic activity. However, there is only one meaningful study concerning its antiparasitic activity, especially in terms of its antileishmanial effects. In the present study, this particular activity was evaluated against Leishmania major-GFP with regard to the mode of action. In this work resveratrol has been evaluated for its antileishmanial activity against Leishmania major-GFP using a broad range of methods (MTT assay, flow cytometric analysis i.e. FACS, microscopic investigations). The FACS analysis showed only moderate activity against promastigotes in concentrations ≤ 35 µg/mL (≙ ≤ 153.2 µM), but significant effects at concentrations ≥ 45 µg/mL (≙ 197.2 µM). In addition, a concentration-dependent reduction of the GFP-signal was observed in infected macrophages (BMMΦ: IC50 value was 9.9 µg/ml (≙ 43.6 µM) and J774-G8: IC50 value was 24.8 µg/mL (≙ 108.6 µM)). Resveratrol unexpectedly diminished an important defence strategy of macrophages against intracellular pathogens, i.e. the production of NO. In addition, resveratrol showed only moderate direct NO-scavenging activity in cell-free (SNP) and cell-based assays, while Western blots indicated reduced expression levels of iNOS protein after treatment with resveratrol. On the one hand, the concentration-dependent cytotoxic effects suggest that resveratrol is not a suitable antileishmanial agent. On the other hand, the cytotoxic potential may be useful for the treatment of other diseases on the rise such as cancer, provided tumour cells are selectively impaired. Consequently, studies on the anti-carcinogenic activity of resveratrol appeared essential and represent a further major piece of this work. The A549 cell line was used to investigate the correlation between the formation of reactive oxygen species (ROS) and their impact on the development of cancer. Resveratrol induced programmed cell death in A549 cells at concentrations ≥ 15 µg/mL (≙ 65.7 µM). Apoptosis was associated with a significant increase of caspase 3 activity, evidenced by a colorimetric assay and Western blotting. In addition to insights into the dependency of ROS production and induction of apoptosis, the origin of the ROS species was clarified in the A549 cell model.