Analyse posttranslationaler Modifikationen von Kernhüllenproteinen

Abstract

Zusammenfassung Die Kernhülle (KH) ist auf Proteinebene eines der am wenigsten charakterisierten Kompartimente in eukaryotischen Zellen. Nur wenige spezifisch in der KH lokalisierte Proteine sind bekannt. Abgesehen von der Deassemblierung der KH zur Mitose hin ist über Signalwege, die Komponenten der inneren Kernmembran einbeziehen, nichts bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit versuchte ich, über die Analyse von posttranslationalen Modifikationen von KH-Proteinen unter Anwendung immunchemischer gelelektrophoretischer und massenspektrometrischer Methoden Hinweise auf solche Signaltransduktionsereignisse zu finden. Ich konnte nachweisen, daß in KH- Präparaten aus Neuro 2a-Zellen der Maus und PC12-Zellen der Ratte tyrosinphosphorylierte Proteine vorkommen. Mit Hilfe der MALDI- Massenspektrometrie wurden mehrere Kandidatenproteine für Tyrosinkinasesubstrate identifiziert, darunter ein Protein des Kernporenkomplexes sowie Proteine aus der inneren Kernmembran und Kernlamina. Jedoch gelang keine direkte Sequenzierung tyrosinphosphorylierter Peptide. Mit Hilfe Phosphopeptid-spezfischer Parent Ion Scans auf einem Nanoelektrospray- Massenspektrometer (in Kooperation mit Dr. G. Neubauer, EMBL Heidelberg) wurden vier Phosphorylierungsstellen des Lamina-assoziierten Polypeptids 2b (LAP 2b ) zur Interphase des Zellzyklus identifiziert, Thr 74, Thr 159, Ser 176 und Ser 179. Drei der Phosphorylierungsstellen (Thr 159, Ser 176 und Ser 179) liegen innerhalb eines nur 20 Aminosäuren langen Sequenzabschnittes von LAP 2b und bilden eine hochphosphorylierte Proteindomäne, die vermutlich Signale, die über verschiedene Proteinkinasen vermittelt werden, integrieren kann.

Abstract The nuclear envelope (NE), at the molecular level, is one of the least characterized compartments of eukaryotic cells. Up to now there are only few proteins known to be specifically located in the nuclear membranes. Apart from nuclear envelope disassembly during mitosis there is no knowledge about signal transdution phenomena involving NE proteins. In this work, I tried to trace such NE signal transduction phenomena by analysing posttranslational modifications of NE proteins applying immunochemistry, gel electrophoresis and mass spectrometry. My experiments demonstrated the presence of tyrosine- phosphorylated proteins in NE preparations from mouse Neuro 2a cells and rat PC12 cells. Among the putative tyrosine kinase substrates identified by MALDI mass spectrometry were a component of the nuclear pore complex and proteins of the inner nuclear membrane and lamina. However, the detection and sequencing of phosphopeptides from unfractionated peptide mixtures by MALDI-MS failed. Applying phospho-specific parent ion scans on a nanoelectrospray mass spectrometer (in collaboration with Dr. G. Neubauer, EMBL Heidelberg), four phosphorylation sites of the lamina-associated polypeptide 2b (LAP 2b ) were identified at the interphase of the cell cycle, Thr 74, Thr 159, Ser 176 and Ser 179. Three of the identified sites (Thr 159, Ser 176 and Ser 179) are located within a twenty amino acid stretch of the protein and create a highly phosphorylated protein domain which is likely capable of integrating signals transduced by different protein kinases.